Meco SB

CRYPTOGAMIE

MYCOLOGIE

TOME 19 Fascicule 1-2 1998

? JUIL. 1998

CRYPTOGAMIE Mycologie ANCIENNE REVUE DE MYCOLOGIE fondée par R. Heim en 1936 Directeur de la publication : Helene Bischler-Causse

Rédaction : Bruno DENNETIERE & Jean MOUCHACCA EDITEU! .D.A.C. — 12 RUE BUFFON F-75005 PARIS

COMITÉ DE LECTURE

A. BELLEMERE (Paris). J. BOIDIN (Lyon), D. CHABASSE (Angers), К. COURTECUISSE (Lille), G. DURRIEU (Toulouse), J. FAYRET (Toulouse), W. GAMS (Baarn), С. L. HENNEBERT (Louvain-la-Neuve), P. JOLY (Paris), C. MONTANT (Toulouse), C. MOREAU (Brest), D. N. PEGLER (Kew), M.-F. ROQUEBERT (Paris), B. SUTTON (Kew), G. TURIAN (Genéve), D. ZICKLER (Orsay).

MANUSCRITS

Les manuscrits doivent être adressés directement à la rédaction. La rédaction peut demander l'avis d'un lecteur même s'il n'appartient pas au Comité de Lecture. Bien qu'étant une revue de langue française, les articles rédigés en anglais, allemand, italien et espagnol sont acceptés. Les disquettes de micro-ordinateurs (PC ou Mac) sont vivement souhaitées. Les recommandations aux auteurs sont publiées dans le fascicule 1 de chaque tome. Les auteurs recevront 25 tirés-à-part gratuits ; les exemplaires suplémentaires seront à leur charge.

TARIFS DES ABONNEMENTS tome 19, 1998 CRYPTOGAMIE comprend trois sections : Algologie, Brtologie-Lichénologie, Mycologie

Pour une section : France : (380 F ht) 387,98 F ttc Étranger : 410,00 F Pour les 3 sections : France : (1030 F ht) 1051,63 F ttc Etranger : 1130,00 F

Paiement par chèque bancaire ou postal à l'ordre de

A.D.A.C. — CRYPTOGAMIE (CCP La Source 34 764 05 S) adressé à : A.D.A.C. 12 rue Buffon, F-75005 Paris

CRYPTOGAMIE, Mycologie est indexé par Biological Abstracts, Current Contents, Geo Abstracts, GEOBASE, Publications bibliographiques du CNRS (Pascal).

Copyright — 1998. CRYPTOGAMIE-ADAC Illustration de la couverture : Laboulbeniales, dessin inédit de J. Balazuc

Source : MNHN, Paris

CRYPTOGAMIE

MYCOLOGIE TOME 19 FASCICULE 1-2 1998

CONTENTS

J. PERREAU — Patrick JOLY (6 novembre 1932-22 octobre 1997) ............

S. RAPIOR, S. BREHERET, T. TALOU, Y. PELISSIER, M. MILHAU & J.-M. BESSIERE — Volatile gc of fresh Agrocybe aegerita and Tricholoma sulfureum

F. GAITIS — Response of Aspergillus carbonarius to Tween 80. My protein, RNA and chitin content

G. PLATAS, F. PELÁEZ, J. COLLADO, G. VILLUENDAS & M. T. DÍEZ Screening of antimicrobial activities by aquatic hyphomycetes cultivated on various nutrient sources .....................

lial growth,

Р. KAISER — Relations of Leucopaxillus giganteus, enia of fairy rings, with soil microflora and grassland plants . .

Y. KOULALI, A. ES-SGAOURI & R. DARGENT — Effects of monensin on ultrastructure and chemical composition parietal fractions of Botrytis CITAR eoo t nee bs Std bn cin УДК ТӘ poe dc

B. RANKOVIC — Populations of fungi in some reservoirs in Serbia...........

A. VERBEKEN & J. VESTERHOLT — A new Lactarius species from Scandi- naviain the section Dapetes ................... А

L. RYVARDEN — The genus Aleurocystis .....:...........

F. D. CALONGE & D. N. PEGLER — Zelleromyces hispanicus Sp. nov. (Russulales, Elasmomycetaceae), an orange-red [Usu p ly related to Lactarius aurantiacus о.

B. MORENO-ARROYO, J. GOMEZ & F. D. CALONGE — Zelleromyces gien- nensis sp. nov. (Russulales), a gasteroid fungus from the southern of Spain.

Y. WANG, G. MORENO, L. J. RIOUSSET, J. L. MANJON, G. RIOUSSET, G. FOURRE, G. DI MASSIMO, L. G. GARCIA- MONTERO & 1. DIEZ — Tuber pseudoexcavatum sp. nov. a new species from China commercialised in Spain, France and Italy with additional comments on Chinesetruflles reader 2 аА

Bibliothèque Centrale Muséum

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Source : MNHN, Paris

F. ESTEVE-RAVENTÓS, À. BANARES, E. BELTRÁN & J. L. RODRÍGUEZ — Mycological study of the biosphere reserve « El Canal y los Tiles » (La Palma, Canary Islands). IV. Agaromycetidae (part. 3). Genus

Inocybe. use 121 C. OCHOA, G. MORENO, A. ALTÉS & H. KREISEL — Calvatia pygmaea

(Gasteromycetes) in the deserts of Baja California Sur (Mexico) ..... a H. NEZZAR-HOCINE, R. J. BOUTEVILLE, J. GUIMBERTEAU, К. PERRIN

& G. CHEVALIER — Macrofungal flora associated with Cedrus

atlantica (Endl.) Manetti ex Carriére II — Ectomycorrhizal fungi in a

cedar plantation (Djurjura mountains, Algeria) ....................... 139 New taxa and new combinations proposed in Cryptogamie-Mycologie 191-2)... 163 Instructions to authors... 165

Source : MNHN. Paris

Cryptogamie, Mycol, 1998, 19 (1-2) : 1-14 1

Patrick JOLY (6 novembre 1932-22 octobre 1997)

Emporté par une implacable maladie, Patrick JOLY s'est éteint le 22 octobre 1997 à Paris, non loin du Laboratoire de Cryptogamie du Muséum National d'Histoire Naturelle oü, pendant prés de quarante années, il a travaillé comme chercheur en phyto- pathologie et mycologie. Directeur de Recherche au C.N.R.S., ayant exercé différentes fonctions administratives et d'enseignement, ayant également participé à l'activité de plusieurs Sociétés scientifiques, il avait dans des horizons trés divers, bien au delà du cadre de la Biologie végétale, de nombreux collègues et amis qui appréciaient son acuité d'esprit, sa vaste culture tout comme son inalterable affabilité. Tous ont ressenti sa disparition avec une peine sincère.

Patrick JOLY est né le 6 novembre 1932 à Villemomble (Seine-Saint-Denis), localité de l'est parisien moins urbanisé qu'aujourd'hui, dans une famille d'imprimeurs liée aux milieux des arts, notamment la musi Ses études au Lycée Montaigne lui apportent, en plus des connaissances qu'il doit déjà à son entourage, une solide formation tant littéraire que scientifique. Il a toutefois une prédilection pour les Sciences Naturelles, en particulier la Botanique à laquelle un oncle l'a initié. C'est ainsi que, après avoir obtenu en 1950 la deuxième partie du baccalauréat, section Sciences Expérimentales, et sur le conseil de l'un de ses professeurs, il prépare — et réussit en juin 1951 —, le concours d'entrée à l'Ecole Nationale Supérieure Agronomique de Grignon. Trois ans plus tard exactement, il quittera cet établissement avec le diplôme d'Ingénieur Agricole. Dès ce moment, il se fixe un objectif : travailler sur la génétique des végétaux.

Source : MNHN, Paris

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PATRICK JOLY

A Grignon cependant, il commence à découvrir le monde des champignons en suivant les cours de J. MONTEGUT et les excursions sur le terrain que celui-ci dirige. Pour effectuer le stage de fin d'études demandé par М. GUILLEMAT, phytopathologiste à l'Ecole, le jeune homme est présenté par son ancien professeur de classe supérieure au Lycée Louis-le-Grand, M. CAZALAS qui avait été éléve du botaniste et mycologue Fernand MOREAU, au fils de ce dernier, phytopathologiste au Laboratoire de Cryptoga- mie du Muséum. Claude MOREAU et Mireille MOREAU, son épouse, accueillent l'étudiant et lui proposent d’ examiner le comportement en culture d'un Hyphomycète parasite de plantes, l’ Alternaria dauci f. sp. solani. Patrick JOLY démontre que, sur milieu artificiel, ce champignon perd rapidement ses capacit sporuler et que l'inhibition de germination in vitro de ses spores ne peut donc pas — contrairement à ce qu'avangait l'américain Mac CALLAN — être utilisée comme test d'évaluation de l'efficacité du pouvoir fongicide de substances chimiques.

Dans le temps méme oü, en juin 1954, il achéve un Mémoire sur ce sujet, Patrick JOLY entre au Laboratoire de Cryptogamie dirigé par Roger HEIM, pour y préparer une thése de Doctorat au titre de Boursier du Muséum. Il passe les trois certificats d'Etudes Supérieures (Physiologie Générale, Botanique, Géologie) nécessaires pour obtenir la Licence és Sciences Naturelles, avant de partir au service militaire qui dure alors plus de deux ans. Envoyé dix-sept mois en Algérie, plus précisément en Kabylie, il s'attache, malgré les hostilités, à récolter de nombreux échantillons de champignons parasites de végétaux. A son retour au Laboratoire, début 1959, il obtient gráce à l'appui de R. HEIM un poste au C.N.R.S et peut se consacrer à des recherches sur les Alternaria et genres voisins, alliant avec méthode, prélévements sur le terrain, essais culturaux, patientes ions au microscope et minutieuses vérifications dans les ouvrages de la bibliothe- que qu'il connaissait mieux que personne.

Souhaitant préciser chez ces champignons une systématique jusque-là presque uniquement basée sur l'aspect morphologique des spores pluriloculaires, Patrick JOLY introduit dans son travail l'analyse de criteres physiologiques et biologiques ; il consi- dére par exemple le taux de sporulation, la vitesse de croissance du mycélium ou les liens étroits existant entre le métabolisme, de l'azote par exemple, et le pouvoir patho- gene. Utilisant la méthode hématimétrique avec une rigueur accrue pour évaluer les quantités de spores produites par chaque culture, il réalise également de véritables dissections de spores vivantes afin d' examiner les modalités des inhibitions de la germi- nation entre loges d'une méme spore. Il méne à bien ces délicates expérimentations grâce, en particulier, aux techniques de micromanipulation apprises, à l'Institut Pasteur de Paris, auprés de P. DE FONBRUNE qui les a perfectionnées. Accompagnés de dessins finement réalisés, les résultats des observations font l'objet de toute une série de publications dont une These de Doctorat d'Etat intitulée « Le genre Alternaria ». Celle-ci, reprise pour l'essentiel dans un ouvrage édité par Paul LECHEVALIER, est brillamment soutenue le 24 janvier 1964 à la Faculté des Sciences d'Orsay, devant un jury composé des Professeurs G. MANGENOT, M. CHADEFAUD, J. CHEVAUGEON et R. HEIM. Ce travail succede à celui de P NEERGAARD paru en 1945 et devient aussitót une référence sur le sujet. Mais le jeune chercheur, toujours sensible à ce qui touche au domaine des livres et aux techniques d'édition, sera surtout fier — il aimait à le rappeler — de voir son DE article imprimé dans les pages du Bulletin de la Société Mycologique de France, en Ў

D'autres Micromycètes attirent l'attention de Patrick JOLY et le conduisent à effectuer différents travaux de Mycologie appliquée. Il publie ainsi des relevés floristiques de certaines régions de France, d'Europe centrale et de zones tropicales, également des

Source : MNHN, Paris

PATRICK JOLY $

révisions critiques chez des champignons parasites des palmiers, d'arbres fruitiers ou de diverses plantes cultivées, décrivant par exemple avec P. COUR le Cercospora selaginella- rum, agent d'une maladie des sélaginelles dans les serres du Muséum et du Phytotron à Gif-sur-Yvette. Il aborde aussi quelques problémes plus importants, tels ceux concernant les pourritures des bananes entre la récolte et la consommation, ou encore les pourritures noires des agrumes. Dans cette optique, il analyse les modalités de succession des semi- saprophytes ou des parasites impliqués dans les « flores primitives », originaires des plantations, et les « flores normales de dégradation », intervenant lors du transport, pour déterminer l'efficacité des moyens de prévention et de lutte.

Avec cette premiére partie de son activité scientifique consacrée à l'examen de divers « Fungi imperfecti », Patrick JOLY se trouve d'emblée confronté au probléme de la classification naturelle des champignons. Vers le milieu de notre siecle s'est justement dessinée une modification profonde des orientations de recherches en Mycologie. Jusqu'alors essentiellement descriptives et morphologiques, les études laissent une place de plus en plus large aux données biologiques et à leur interprétation statistique. Dés le début de sa carriére, Patrick JOLY sait donc que la systématique présente un double róle : d'un côté, c'est un moyen d'étude qui permet — théoriquement du moins — l'identifica- tion des spécimens ; d'un autre côté, sa mission est de séparer et classer les organismes, selon leurs affinités réelles, en faisant appel à toutes les données que peut procurer l'ensemble des disciplines biologiques. En effet, les caractères morphologiques, éminem- ment variables en fonction du mode de vie de chaque individu, non seulement ne peuvent plus suffire pour la délimitation et la classification naturelle des espèces mais constituent trop souvent, du fait de convergences, une source d’erreur et de confusion. Tendre vers une meilleure compréhension des mécanismes intimes de la vie des champignons et de leur fonctionnement par l’utilisation de méthodes expérimentales plus dynamiques, représente le plan directeur des recherches de Patrick JOLY.

Ses idées se sont centrées sur deux thèmes principaux, notion d'espèce et interactions hôtes-parasites, que ce soit en phytopathologie ou, plus largement, en myco- logie, car il disait lui-même n’avoir eu aucun mal à passer de l'une à l'autre. Suivant, dans une époque où le champ des connaissances n’était pas si cloisonné que maintenant, l'exemple de ses Maîtres, il s'intéresse en effet trés tôt, aux Macromycètes. Dès 1959, il rédige de petits articles destinés au grand public et profite de son séjour au Viêt-Nam pour récolter Xylaires, Bolets, Amanites, Russules ou Lentins dans les pinèdes du Lang-Bian afin d'apporter des renseignements supplémentaires sur la répartition géographique des espéces fongiques. Quels que soient les champignons. Micro- ou Macromycétes, dont ils traitent, ses travaux ont pour finalité de contribuer à l'amélioration des connaissances en systématique. Ils lui vaudront des distinctions honorifiques tels que le Prix du Conseil de la Société Botanique de France en 1968 et le Prix MONTAGNE décerné par l'Académie des Sciences en 1978 tandis que l'année suivante lui sera remise la Médaille de vermeil de l'Académie d'Agriculture.

Dans la deuxiéme phase de ses travaux, Patrick JOLY apporte une contribu- tion à l'application de méthodes de traitement numérique des informations systéma- tiques. Avec différentes collaborations dont celle de son épouse Françoise, physicienne, il considére des groupes trés polymorphes : champignons isolés des sols désertiques, espéces fongiques de la flore séminicole des haricots cultivés, Ustilaginales et méme Hépatiques du genre Calypogeia. Le but à atteindre, aprés voir affecté à chacun des caracteres disponibles un indice proportionnel à la quantité d'information qu'il renferme, est de réaliser une synthése de toutes les données connues sur les organismes pris en

Source : MNHN, Paris

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Patrick JOLY (au centre), en octobre 1959 dans la forêt de Fontainebleau, lors des cueillettes destinées au Salon du Champignon organisé par le Laboratoire de Cryptogamie

compte et, par des calculs appropriés, de mettre en évidence la distinction d’ensembles naturels et l'appréciation de leurs affinités, voire de leur hiérarchisation. A la lumière de ces indications qui portent sur des comportements écophysiologiques (réaction à l'éclai- rement ou à la température, halophilie, osmophilie, etc...), Patrick JOLY tire une conclu- sion en analysant la signification de ces « caractéres » en systématique supra-spécifique et évalue les limites de leur utilisation pour la classification. Paru en 1977, l'article qui expose ces résultats, est particuliérement révélateur d'une pensée douée d'un pouvoir aigu d’abstraction et de généralisation, comme l'exige justement la construction de la systema- tique.

A partir de 1980, il aborde la troisieme partie de ses recherches avec l'étude des populations chez des Basidiomycètes, les Pleurotes. En collaboration avec Roger CAILLEUX, mais aussi avec le concours de botanistes, il considére les Pleurotes des Ombelliféres. Très voisines les unes des autres mais inféodées, dans la nature, à des espèces différentes comme le Panicaut (Eryngium campestre), la Férule ou les Laserpitium, ces formes gardent leurs caractéristiques en culture artificielle. Tant sur la base des morpho- logies basidiocarpiques, des particularités culturales, du polymorphisme enzymatique et des caryotypes que sur celle des spécificités pathogénes, Patrick JOLY et Roger CAILLEUX reconnaissent chez ces champignons quatre entités dont l'ensemble est

Source : MNHN, Paris

PATRICK JOLY

interprétable en terme d'éco — ou coeno-espèce. Ils montrent aussi que l'effet pathogene des Pleurotes des Ombelliféres reléve du modele des pourridiés perthotrophiques, car dans la nature, ces champignons sont des parasites agressifs, tuant leur hóte et fructifiant ensuite sur les racines mortes. Leurs observations les conduisent cependant à mieux définir les relations de co-adaptation, aux confins de la symbiose, entre populations du champi- gnon et populations de plantes-hótes qui profitent dans une certaine mesure de la présence du parasite. En effet, les Pleurotes attaquent moins facilement les Eryngium adultes mais y provoquent une stérilité du pollen : l'augmentation du taux de fécondation croisée chez les plantes encore résistantes est ainsi favorisée et induit une amélioration de la quantité de graines qui germent et donnent des plantes vigoureuses. Ce processus contribue donc au renouvellement des Panicauts et à la pérennité de la station.

Par la suite et toujours avec Roger CAILLEUX, Patrick JOLY s'intéresse à la délimitation des espéces chez des Pleurotes saprophytes du groupe Pleurotus pulmonarius / ostreatus dont les basidiocarpes sont d'habitus et de morphologie presque semblables, poussant quelquefois sur les mêmes essences. Il étudie les conditions d'apparition dans la nature et les caractéristiques des souches en culture, comme la croissance mycélienne et la thermotolérance. Ces observations sont complétées par l'analyse de la structure génétique chez des populations de ces champignons. L'existence de deux espèces distinctes est ainsi confirmée : de plus, des indications originales sont apportées sur les phénomènes de rupture de phase entre l'équilibre endémique et le déséquilibre épidémique qui surviennent au niveau des populations locales de ces Pleurotes lignicoles.

Tous ces travaux ont été réalisés dans le cadre d'une carrière de chercheur au Centre National de la Recherche Scientifique. Attaché de Recherche en 1960, chargé en 1964, Patrick JOLY devient maître de Recherche en janvier 1969 et sera directeur de Recherche au début de 1984. A partir de 1972, il se voit d’abord confier la direction de l'Equipe de Recherche n° 120 du C.N.R.S. implantée au Laboratoire de Cryptogamie du Muséum, puis de 1976 à 1983, celle de l'équipe « Spore, sporogenèse, sporulation » du Laboratoire associé au C.N.R.S. n° 257. En méme temps, il dirige trois Thèses de 3° cycle et, en 1984, la These d'Etat de M.-C. BOISSELIER qui traite de la variabilité génétique chez les Pleurotes des Ombellifères.

Mais parallèlement, il assume de multiples responsabilités de gestion de la recherche. Secrétaire de la Section 20 (Biologie et Physiologie Végétales) du Comité National de la Recherche Scientifique (C.N.R.S.) de 1971 à 1975, il est élu président de la Section 27 de ce méme Comité pour la période 1976-1980, tout en étant également vice-président du Comité National des Sciences Biologiques. Il est par ailleurs membre de divers Conseils comme le Conseil Supérieur des Univer (Sciences Biologiques), pré- sident du Comité Consultatif du Cours de Mycologie Médicale de l'Institut Pasteur dés 1979 : il fait aussi partie du Jury d'Agrégation de Pharmacie (1983) et, depuis 1985, du Jury des concours de recrutement en Sciences Pharmaceutiques des Personnels de l'Ensei- gnement Supérieur.

Nombreux sont ceux qui ont bénéficié de son enseignement à l'occasion de cours. Ainsi, lors de ses missions botaniques au Viét-Nam (1962 et 1967), Patrick JOLY est chargé d'un cours de Mycologie et de Pathologie Végétale à l'Ecole Supérieure Agrono- mique, Forestiére et Vétérinaire de Saigon ainsi que d'un enseignement de 3° cycle à la Faculté des Sciences de cette méme ville. A Paris, à la demande de E MARIAT et G. SEGRÉTAIN, puis de C. de BIÈVRE, il participe de 1976 à 1997 au Cours de Mycologie Médicale de l'Institut Pasteur. Pendant plusieurs années, il expose le probléme des champignons vénéneux ; sans retenir l'aspect anthropomorphique de la consommation de certaines espèces, il s'attache surtout à la signification botanique de l'existence de subs-

Source : MNHN, Paris

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tances qui, élaborées par le métabolisme fongique, ont une action toxique vis-à-vis de l'organisme animal. Ensuite, il présente dan s leçons les caractères généraux des champignons et insiste sur la diversité et l'originalité des cycles de reproduction. Ce thème sera repris pour une série de conférences données au Muséum, lors d’un enseignement sur la systématique.

En outre, son activité s’est étendue au développement de structures fédératives faisant intervenir des Laboratoires de différentes Universités, du Muséum, de l'Institut Pasteur ou de ’I.N.R.A. Ces projets ont concerné tant la mise en place d'une Banque de souches fongiques dans le cadre de la Collection Nationale de Cultures de Microorganis- mes que l'élaboration d'un programme d'ensemble sur la Systématique végétale. Toute- fois, certaines circonstances survenues dans une période de remaniement des dispositions administratives de la Recherche ne lui ont pas permis de réaliser ce qu'il avait souhaité

Source : MNHN, Paris

PATRICK JOLY 7

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Premières lignes du manuscrit de l'« Hommage à André Maublanc », rédigé par Patrick JOLY en 1981.

pour le Laboratoire de Cryptogamie ; il en fut légitimement affecté et par la suite, privilégia ses recherches.

Chercheur infatigable, organisé et méthodique, Patrick JOLY reste malgré ses multiples obligations, d’une disponibilité d'esprit à toute épreuve. Qui d'entre nous au Laboratoire n'a pas frappé inopinément, au 4* étage, à la porte de son petit bureau éclairé par une lucarne grande ouverte sur le ciel, pour demander un renseignement ? Abandon- nant aussitót les feuilles qu'il vient de couvrir d'une écriture serrée, il pose sa cigarette et, avec un sourire, assure qu'il reprendra aisément le fil de ses pensées. Attentif aux problè- mes qui lui sont posés, il suggére une idée, donne un conseil, trouve une solution. Lors des collaborations, où d'ailleurs il prend en général plus que sa part de travail, on reconnait les signes de sa curiosité intellectuelle, de son immense mémoire, de sa vive imagination tempérée par une prudence reflechie. Souvent, au cours de la rédaction, pour préciser un terme ou affiner une idée, sont abordées des questions d'étymologie ou d'évolution des concepts en systématique. Car, si les controverses nomenclaturales, qu'il qualifie volon- tiers de débats procéduriers, ne lui importent guére, l'histoire des sciences par contre le passionne.

Dans ce domaine, Patrick JOLY publie quelques études. Avec J. SEMAL et D. LAMY, il analyse des documents permettant de mieux définir les étapes de liden- tification du Phytophthora infestans, responsable de l'épidémie qui ravagea les cultures de pommes de terre en Europe, en 1845. Il a l'occasion de s'intéresser à un herbier

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mycologique étiqueté selon la nomenclature d’Adanson, aux champignons en cire venant de Vienne et surtout, aux magnifiques velins de la collection « ancienne » de champi- gnons — ce qui l'amène à réaliser un tableau comparatif des concepts génériques chez les champignons, de Tournefort à Micheli. Mais il a également un regard personnel sur les développements de la Biologie végétale et de la « Cryptogamie » depuis la fin du XIXème siècle : aussi bien dans les milieux agronomiques qu'au Muséum, à l'Institut Pasteur ou à la Société Mycologique de France, il rencontre tous les professeurs qui ontété les acteurs de cette évolution. Il leur voue une profonde estime et les écoute attentivement parler de leur vie, de leur expérience, de leurs travaux. Quel plaisir alors d'entendre Patrick JOLY rapporter ces souvenirs et raconter des anecdotes qui faisaient revenir au siécle dernier : on se retrouvait au temps du chimiste Michel-Eugene CHEVREUL, mort plus que centenaire en 1889 et qu'avait connu le biologiste Gabriel BERTRAND — né en 1867 et disparu en 1962 — ou à celui des naturalistes-voyageurs ! Plus pratiquement, la collection de portraits de cryptogamistes, au Laboratoire, doit sa mise en place à cet attachement que Patrick JOLY témoignait aux traditions et aux documents anciens. Par contre lui-méme, à moins d'étre dans un groupe, n'aimait guére étre photographié et surtout pas dans l'attitude qu'il jugeait trop conventionnelle, du scientifique devant son microscope.

Avec la personnalité et l'érudition qui sont les siennes, Patrick JOLY ne peut manquer de souhaiter partager son savoir et faire découvrir le monde des champignons. Il assure cette mission de diffusion des connaissances à tous les niveaux et de toutes les fagons. Ce sont des informations données sur le terrain, à l'occasion de nombreuses conférences ou lors d'expositions mycologiques, en particulier au moment du Salon du Champignon, au Muséum, auquel il apporta un concours actif pendant plus de vingt-cinq ans. Ce sont aussi des articles destinés au grand public, des clés pratiques de détermination ou des synthèses plus ardues, publiées dans Г Encyclopaedia Universalis ; des chapitres d'ouvrages réservés aux spécialistes ou des livres, intitulés « Les Champignons » ou « Guide des Champignons », plusieurs fois réédités et qui représentent de véritables petits traités de Mycologie.

Une large part du temps de Patrick JOLY est également consacrée aux activités d'associations scientifiques où il trouve une atmosphère à la fois savante et amicale qui lui plait. S'il est ainsi membre d'un certain nombre d'entre elles — Société Botanique de France dés le 9 décembre 1955, Naturalistes Parisiens parmi lesquels il est introduit par A. MAUBLANC, Société Frangaise de Phytopathologie que fonde G. VIENNOT- BOURGIN en 1971, Société Frangaise de Systématique — c'est à la Société Mycolo- gique de France oü il est présenté par C. et M. MOREAU, qu'ira son attachement le plus profond. Il lui marquera en vérité un dévouement absolu, depuis son admission, à l'Assemblée générale du 2 mars 1959, jusqu'à la limite de ses forces, en fin d'été 1997. Elu au Conseil d'Administration en 1963 à la place de P. GUINIER, il entre au Bureau l'année suivante en tant qu'archiviste-bibliothécaire adjoint. Devenu à partir de 1966 secrétaire chargé du Bulletin, il veut bien, à la suite du décès de Р. OSTOYA pour qui il avait la plus grande admiration, exercer durant quelques mois, en 1969-1970, les fonc- tions de secrétaire général intérimaire, avant que H. ROMAGNESI n'en prenne la responsabilité ; puis il assure la présidence de 1985 à 1988, dans une période difficile pour la Société qui doit trouver un local pour son siège social et enfin, le titre de Membre d'Honneur lui est conféré par le Conseil d'Administration, le 20 janvier 1996. Aucune tâche, si considérable ou fastidieuse soit-elle, ne le décourage : rédaction des rapports sur les sessions annuelles, correction d'épreuves, et surtout, mise en pages du Bulletin. En tant que directeur de la publication depuis 1971, il tient à faire profiter la S.M.F. de

Source : MNHN, Paris.

PATRICK JOLY 9.

tout son savoir concernant les règles typographiques ou la composition en imprimerie. Connaissant admirablement la Société, sa gestion, ses statuts mais aussi son histoire, il aura à cœur pour célébrer le Centenaire, en 1984, de réunir articles et documents photo- graphiques sur les nombreux mycologues qui, de près ou de loin, ont participé à la vie de cette association où lui-même a tant œuvré avec une persévérante attention et un parfait désintéressement.

Sens du devoir, fermeté de convictions mais grande tolérance pour les idées des autres, vivacité de l'intelligence, tels étaient quelques uns des traits marquants de la personnalité de Patrick JOLY. Réservé et tellement sociable, perspicace et indulgent, réfléchi et si enjoué, une lueur amusée passerait dans son regard, saisissant tout le paradoxe à vouloir donner les multiples facettes de son caractère. Tous ceux qui l'ont bien connu, se souviendront de sa modestie réelle et de la qualité de son amitié.

J. PERREAU

LISTE DES PUBLICATIONS DE PATRICK JOLY

1954 — Alternaria dauci (Kühn) Groves & Skolko f. sp. solani (ЕЙ. & Mart.) Neergaard et son utilisation comme test de fongicides, Rapport bibliographique, Ecole Nat. d'Agriculture. Grignon, 5 juin 1954, 43 p. dactylogr.

1959 — Variations morphologiques et notion d'espèce chez le genre Alternaria (Nees) Wiltshire. Bull. Soc. Mycol. France, 75, 2 : 149-158.

1959 — Russules et Lactaires. Rustica, n? 38 : 1364.

1959 — Les Cèpes. Rustica, n° 41 : 1472-1473.

1959 — Les champignons : les plus redoutables ennemis des arbres. Science et Nature, n° 35 : 4-7.

1959 — Une importante manifestation mycologique et phytopathologique : le Salon du Champi- gnon. Fruits d'Outre-Mer, 14, 10 : 431-432.

1960 — Attention aux champignons des arbres. Rustica, n° 9 : 332

1960 — Les Levures. Rustica, n° 24 : 928.

1960 — Champignons d'été. Rustica, n° 31 : 1176.

1960 — Sur les causes d'erreurs dans l'emploi de la méthode hématimétrique pour évaluer le taux de sporulation chez les champignons. Bull. Soc. Mycol. France, 76, 3 : 275-290.

1960 — Les champignons des prés. Rustica, n° 41 : 1586.

1960 — Champignons d'hiver. Rustica, n° 49: 1928.

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1989 — Les Pleurotes des Ombelliféres : modèle de « pourridié naturel » et d’ « espèce mycologi- que » chez les Basidiomycétes « symbiotiques » — II. Co-adaptation et équilibre endémi- que. Bull. Soc. Mycol. France, 105, 1 : 7-27 (R. CAILLEUX, P. JOLY, M.-Th. CERCEAU- LARRIVAL, LP. BOIVIN et P. CALLAC)

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Source : MNHN, Paris

14 PATRICK JOLY

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Les reproductions photographiques ont été réalisées par M. Dumont-Vialatte, Photographe au Laboratoire de Cryptogamie ( M.N.H.N.), que nous remercions pour son concours.

Source : MNHN, Paris

Cryptogamie, Mycol. 1998, 19 (1-2) : 15-23 15

VOLATILE COMPONENTS OF FRESH AGROCYBE AEGERITA AND TRICHOLOMA SULFUREUM

Sylvie RAPIOR™, Sophie BREHERET?, Thierry TALOU®, Yves PELISSIER®, Michel MILHAU" and Jean-Marie BESSIERE®

“Laboratoire de Botanique, Phytochimie et Mycologie, Université Montpellier I, Faculté de Pharmacie, 15 av. Charles Flahault, 34060 Montpellier cedex 2, France Fax number: 33 (0) 467 411 940 E-mail: rapior@pharma.univ-montpl.fr PLaboratoire de Chimie agro-industrielle, Institut National Polytechnique de Toulouse, Ecole Nationale Supérieure de Chimie, 118 route de Narbonne, 31077 Toulouse cedex, France “Laboratoire de Pharmacognosie, Université Montpellier I, Faculté de Pharmacie, 15 av. Charles Flahault, 34060 Montpellier cedex 2, France "Laboratoire de Chimie appliquée, École Nationale Supérieure de Chimie, 8 rue de l'École Normale, 34296 Montpellier cedex 5, France + Address for correspondence.

ABSTRACT: Two fresh wild mushrooms Agrocybe aegerita and Tricholoma sulfureum were investi- gated for volatile components by headspace concentration, organic solvent extraction and water- distillation using Gas Chromatography/Mass Spectrometry. Thirty-one and forty-two volatile cons- tituents were identified from À. aegerita and T. sulfureum, respectively. C, derivative (3-octanone), phenylethyl derivatives (2-phenylethanal, 2-phenylacetamide, 2-phenylcrotonaldehyde) and mono- terpenes («-pinene, linalool were the main volatile components of fresh A. aegerita. 3-Hydroxy- butan-2-one and 2-methylbutanol could have a role in the lees of wines flavour of this species. Cy compound (1-octen-3-ol), benzene derivatives (ethylbenzene, styrene, xylene), monoterpenes (limo- nene, linalool) and indole derivatives were the major volatile compounds of T. sulfureum. Indole and 3-formylindole could be responsible for the gas-like odour of Т. sulfureum. Comparison of extraction methods reveals large qualitative and quantitative differences in volatile metabolites for both fresh species,

KEY WORDS INDEX: Mushroom; Basidiomycotina; Volatile components; Agrocybe aegerita; Tricholoma sulfureum; Solvent extraction; Dynamic headspace concentration; Water distillation.

RESUME: Les composés volatils de deux champignons sauvages frais, Agrocybe aegerita et Tricho- loma sulfureum ont été étudiés par concentration des effluves, extraction par solvant et hydrodistilla- tion, et identifiés par Chromatographie en phase Gazeuse couplée à la Spectrométrie de Masse. A. aegerita et T. sulfureum présentent respectivement 31 et 42 composés volatils. L’octan-3-one, le 2-phényléthanal, le 2-phénylacétamide, le 2-phénylcrotonaldéhyde ainsi que les monoterpènes (z-pinéne, linalol) sont les principaux composés des sporophores d'A. aegerita. La 3-hydroxybutan- 2-one et le 2-méthylbutanol pourraient jouer un rôle dans l'odeur de lie de vin de ce champignon frais. Par ailleurs, l’oct-1-èn-3-ol, les dérivés benzéniques (éthylbenzéne, styréne, xylène), les monoterpénes (limonène, linalol) et les dérivés indoliques sont les composés volatils majoritaires de 7. sulfureum. L'indole et le 3-formylindole pourraient être responsables de l'odeur de gaz d'éclairage de 7. sulfureum.

Source

MNHN, Paris

16 S. RAPIOR et al.

INTRODUCTION

For ages, mycologists have been sniffing to their specimens for determining species. Considering the unique and subtle odours of mushrooms and because more and more industries are turning to a search for novel sources for natural aroma components, general reviews on mushroom flavour (Claus, 1978; Maga, 1981; Mau et al., 1994; Rapior et al., 1998) and studies relative to specific mushroom odours have been reported such as the anise-like aroma of Hydnellum suaveolens (Wood et al., 1988; Solberg, 1989) and Clitocybe odora (Breheret et al., 1996), the almond-like odour of Agaricus augustus (Wood et al., 1990), the sweet odour of Hebeloma sacchariolens (Wood et al., 1992), the cucumber odour of some Tricholomataceae and Entolomataceae species (Wood er al., 1994), the garlic-like aroma of Marasmius alliaceus (Rapior et al., 1997a) and the coal-tar odour of Tricholoma inamoenum (Watson et al., 1986).

Although the fresh mushrooms have characteristic aroma properties, few published studies exist on comparative methods for the volatile composition of headspace concentrate, solvent extract and distillate from edible and non-edible species (Vidal ег al. 1986; Buchbauer er al., 1993). Comparison of volatile components from headspace concentrate and distillate was also reported by a few authors (Sulkowska & Kaminski, 1977; Yajima er al., 1981; Charpentier et al., 1986). Moreover, correlation between the odour and the profile of volatile components has been given little attention so far (Watson et al., 1986; Rapior et al., 1997a).

Only one study and none on volatile constituents was reported for odorous Agrocybe aegerita (Takama et al., 1979) and Tricholoma sulfureum mushrooms, respecti- vely. This paper focuses both on the extraction of volatile metabolites from fresh wild basidiocarps of A. aegerita and T. sulfureum by dynamic headspace concentration, organic solvent extraction and water-distillation, and identification of volatile substances using Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC/MS).

MATERIALS AND METHODS

Mushroom material

The fruit bodies representing a combination of young and old sporophores from two wild mushrooms, Agrocybe aegerita (Brig.) Fayod (= Agrocybe cylindracea, Poplar field cap) and Tricholoma sulfureum (Bull.:Fr.) Kummer (Gasworks Knight-cap) were collected in Fall 1996 in the South of France. A. aegerita is an edible mushroom with a fruity-wine flavour and T. sulfureum has a characteristic nauseating smell of gas (Cour- tecuisse & Duhem, 1994 ; Læssoe er al., 1996). The fresh material was brushed clean of forest debris and treated immediately after collection.

Source : MNHN, Paris

AGROCYBE AEGERITA AND TRICHOLOMA SULFUREUM AROMAS 17

Solvent extraction

The volatile components from 250 g of small mushroom cubes (approximately 100 mm?) were extracted with 400 ml of dichloromethane in 500 ml sealed Erlenmeyer flask (Rapior et al., 1996, 1997b). After maceration for seven days, the organic layer was separated and traces of water remoyed with anhydrous sodium sulfate as a drying agent. The dichloromethane extract was then filtered through a glass funnel with Whatman n°1 filter paper and concentrated to 1 ml into a bottle with teflon lined cap using a nitrogen stream.

Dynamic headspace concentration

Fresh chopped mushrooms, i.e., 45 g of A. aegerita and 13 g of Т. sulfureum were placed in a glass cell (0.25 1 capacity) directly connected to a dynamic headspace concen- trator (CHISA device-SGE). Volatile components were concentrated on Tenax trap with astripping gas (Helium) with a constant flow rate set close to 30 ml/min for 20 min at room temperature. Samples were desorbed with a headspace injector (CHISA device-SGE) directly connected to the analytical column. The temperature of desorption was 210°C; the volatile components were cryofocused at -20°C in the column head before to be injected directly in the column (Breheret er al., 1997).

Water-distillation

The finely chopped fresh materials, i.e., 50 g of A. aegerita and 300 g of Т. sulfureum, were water-distilled in an original glass apparatus for 4 h. The condensed water-distillates were extracted with dichloromethane and the solvent then removed in vacuo (Pélissier et al., 1995).

Gas Chromatography-Mass Spectrometry

Analyses were carried out using a gas chromatograph (5892-Hewlett-Packard) and a mass selective detector (5971-Hewlett-Packard) with a potential of 70 eV for ionization by electron impact.

Solvent extraction and water-distillation analyses were performed by a 25 m X 0.23 mm х 0.13 um dimethylpolysiloxane OPTIMA 1 (M-N) fused silica capillary column. The carrier gas was helium with a constant flow rate set close to 0.6 ml/mm. The injector and detector temperatures were 200°C and 220°C, respectively. The column was temperature programmed as follows: 60°C (2 min) to 200°C (4°C/min).

, Headspace analyses were performed by a 50 m x 0.22 mm X 1 um dimethylpo- lysiloxane BP1 (SGE) fused silica capillary column. The carrier gas was helium and the pressure was fixed at 22 psi. The detector temperature was 250°C. The column was temperature programmed as follows: 50°C to 220°C (3°C/min).

Source - MNHN. Paris

18 S. RAPIOR et al.

Volatile component identification

The volatile constituents were identified by matching their mass spectra and retention indices with reference libraries (Stenhagen er al, 1976; Jennings & Shibamato, 1980; Adams, 1989; MacLafferty & Stauffer, 1989) and our own data bank.

RESULTS AND DISCUSSION

Volatile components of A. aegerita

The Су derivatives are the major volatile compound of fresh А. aegerita from headspace concentrate, organic extract and water-distillate. 3-Octanone (fungal-fruity odour) is the major component and l-octen-3-ol (fungal odour) belongs to the minor fraction in the three extracts (Table 1) as described for A. bisporus headspace extract (Fischer & Grosch, 1987). These results are not in agreement with those reported by Takama et al. (1979) twho described the volatile 1-octen-3-ol as the main volatile compo- nent of A. aegerita organic extracts.

The phenylethyl derivatives, ie, 2-phenylethanal (floral-green odour), 2-phenylacetamide and 2-phenylcrotonaldehyde represented more than 24 % of the vola- tile fraction from the extract. Monoterpenes such as 2-pinene (resineous odour) in headspace concentrate and linalool (fresh odour) in both extract and distillate were detected at low levels (Breheret er al., 1997).

3-Hydroxybutan-2-one and 2-methylbutanol with their respective etherous- fruity and dairy notes were detected at high levels in the dynamic headspace concentrate of A. aegerita. Thus, these volatile constituents seemed to have a role in the lees of wine aroma of fresh A. aegerita.

Volatile components of T. sulfureum

The C, compounds are also the main volatile metabolites of fresh 7. sulfureum from headspace concentrate, solvent extract and water-distillate. The major volatile component is l-octen-3-ol in all extracts (Table 2).

The benzene derivatives (ethylbenzene, styrene, xylene, propenylbenzene) repre- sented ca.5% of the volatile fraction from headspace extract.

Monoterpenes i.e., «-pinene, sabinene, B-pinene and p-cymene were detected in headspace concentrate. Limonene and linalool were identified in the three extracts (Bre- heret et al., 1997).

Both indole and 3-formylindole were identified in the dichloromethane extract. Indole (animal odour) that was also detected in the water-distillate, is probably responsible for the town gas odour of T. sulfureum. Indeed, this volatile constituent was previously reported by Hilber (1968) for T. inamoenum (Fr.) Quél., a mushroom described as having a smell of illuminating gas (Moser, 1983). On the other hand, a mixture of benzaldehyde, 1-octen-3-ol and phenylacetaldehyde could also be the basic components of the repulsive "coal tar" aroma of T. sulfureum as described for T. inamoenum by Watson et al. (1986) using sensory tests.

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AGROCYBE AEGERITA AND TRICHOLOMA SULFUREUM AROMAS

19

BPI column Optima 1 column Volatile RE Headspace RE Solvent Steam Compounds Sample? Extract Distillate 3-Hydroxybutan-2-one 707 16.1 715 02 2-Methylbutanol 720 4.8 722 02 Octene 785 78 789 03 Ethylbenzene 850 2.1 p- and/or m-Xylene 860 03 Styrene 878 18 859 2.8 0.5 o-Xylene 883 0.1 a-Pinene 938 03 Benzaldehyde 938 0.8 02 1-Octen-3-one 958 0.9 20 1-Octen-3-ol 965 0.1 966 0.5 03 3-Octanone 966 64.5 962 47.9 37.6 3-Octanol 980 07 983 63 26.2 p-Cymene 1020 03 2-Phenylethanal 1024 1.1 0.8 Limonene 1028 0.1 (E)-2-Octenal 1038 0.1 02 (E)-2-Octenol 1056 19 11.1 Octanol 1060 46 Linalool 1095 2.0 09 2-Phenylethanol 1106 11.0 8.7 (E)-Non-2-enal 1136 0.1 2-Phenylcrotonaldehyde 1250 14 Undecan-2-one 1293 0.1 QE 4Z)-Decadienal 1304 0.1 02 2-Phenylacetamide 1330 11.5 (2E,4B)-Decadienal 1345 03 0.7 4-Hydroxybenzaldehyde 1400 1.1 3-Formylindole 1675 10.3 Tetradecanol 1676 03 0.1 Pentadecan-2-one 1695 10 02

“Different retention indices due to the GC column used; "Relative percentage of the identified volatile based on the GC/MS chromatographic area

Table 1. Volatile composition (percentage) of three extracts from A. aegerita

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20 S. RAPIOR er al. ВР1 column Optima 1 column

Volatile RI“ Headspace RP Solvent Steam Compounds Sample^ Extract Distillate Hexan-2-ol 781 0.4

Octene 785 3.9 789 0.1 (Z)-1,3-Octadiene 817 3.0 823 0.1

Ethylbenzene 850 1.7

p — and/or m-Xylene 860 07

Styrene 878 22 959 0.2 0.5 o-Xylene 883 02

2-Propenylbenzene 934 02

Benzaldehyde 938 3.7 6.2 a-Pinene 938 0.4

Camphene 953 0.1

1-Octen-3-one 956 0.8 958 cal 5.3 1-Octen-3-ol 965 64.2 966 43.3 50.7 3-Octanone 966 11.5 962 0.2 0.8 Sabinene 972 0.1

B-Pinene 979 0.1

3-Octanol 980 2.6 980 0.3 0.5 2-Pentylfurane 986 0.1

p-Cymene 1022 0.1 B-Phellandrene 1028 0.6 1025 0.5

Limonene 1028 0.6 1026 0.6 1.4 2-Phenylethanal 1028 02 0.2 Benzyl alcohol 1035 2.0 0.5 (E)-2-Octenol 1049 0.5 1056 35 Octanol 1052 0.7 1060 0.4 1.9 (E)-Oct-3-en-1-ol 1062 37, Linalool 1084 0.8 1095 0.2 0.4 Undecene 1084 0.1

Nonan-2-one 1090 0.1 2-Phenylethanol 1106 29 i 1,3-Undecadiene 1136 2.0

Decan-2-one 1191 0.1 2-Phenylcrotonaldehyde 1250 0.7 (E)-2-Decenal 1253 0.5 1.2 Undecan-2-one 1293 0.1 Indole 1320 3.4 15.8 2-Phenylacetamide 1330 24.1 Gamma-nonalactone 1355 0.5 4-Hydroxybenzaldehyde 1416 5.1 Benzopyrrolidone 1452 1.8

Nerolidol 1565 0.2 _3-Formylindole 1675 1.8

“Different retention indices due to the GC column used; "Relative percentage of the identified volatile based on the GC/MS chromatographic area

Table 2. Volatile composition (percentage) of three extracts from T. sulfureum

Source : MNHN, Paris

AGROCYBE AEGERITA AND TRICHOLOMA SULFUREUM AROMAS 21

Effect of extraction method on volatile composition

Three main isolation techniques were used, i.e., dynamic headspace concentra- tion, liquid solid extraction into a organic solvent and water-distillation for the investiga- tion of volatile substances from fresh A. aegerita and T. sulfureum. Only the volatile components unambigously identified by both GC and MS methods are reported in Tables l and 2.

The organic extracts from fresh mushrooms contained many primary and secondary metabolites such as lipids, sterols and fatty acids (Regerat ег al., 1976; De Simone et al., 1979; Senatore et al., 1988; Bonzom et al., 1995). Tables 1 and 2 list the volatilizable metabolites detected in our GC/MS experiments at 200°C (injector tempera- ture) from the organic solvent extracts. The water-distillate of fresh mushrooms contained both low and high volatile metabolites of fresh mushrooms. The headspace concentrates contained only volatile components with low volatility indice at room temperature. Thus, only the most volatile constituents of fresh mushrooms are detected at high levels in the headspace concentrates. It is why low molecular weight benzene derivatives, i.e., ethylben- zene, xylenes and styrene as well as monoterpenes are commonly identified in headspace extracts and more rarely reported in solvent extracts and distillates from fresh mushrooms.

Consequently, the volatile composition of mushroom extracts and water- distillates is close to the genuine composition of volatile constituents in fresh mushrooms. Indeed, the major volatile components of solvent extracts are similar to those of water- distillates as reported in Tables 1 and 2. Therefore, qualitative differences appeared for some aliphatic alcohols; 3-octanol, (E)-2-octenol and octanol levels are much lower in the extracts of both fresh mushrooms studied than in the water-distillates. These C, derivati- ves could be present in a linked form in mushrooms; water-distillation should be then responsible for the free aliphatic alcohols formation as already reported by Cravo et al. (1993).

In conclusion, many volatile secondary metabolites are produced by mus- hrooms. The volatile composition of A. aegerita and T. sulfureum is directly dependent of theextraction process as already described for other mushroom species (Charpentier et al., 1986; Vidal er al., 1986). Thus, the headspace concentrates, organic extracts and water- distillates of A. aegerita and Т. sulfureum are attractive natural resources for aroma application in food, pharmacy and cosmetic industries.

ACKNOWLEDGMENTS: F. Gasc (glass-blower) is gratefully acknowledged for helpful conception and realization of well-adapted water-distillation apparatus.

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RESPONSES OF ASPERGILLUS CARBONARIUS TO TWEEN 80. MYCELIAL GROWTH, PROTEIN, RNA AND CHITIN CONTENT.

Fragiskos GAITIS

University of Athens, Institute of General Botany, Pan/polis, Ilisia 157 84, Athens Greece.

*This paper is dedicated to my Professor Dr S. Marakis

ABSTRACT : Studies were carried out to investigate the effects of the surfactant Tween 80 on spore germination, mycelial growth and form of Aspergillus carbonarius and its protein, RNA and chitin content. The presence of increasing (0.2-1.1%) Tween 80 concentrations in the medium: a) reduced the spore germination time from 24h (in the control) to 3h, b) reduced hyphal diameter and chitin content while hyphal branching frequency was increased resulting in the formation of soft, loose and large pellets and c) increased the mycelium dry weight while its protein and RNA content (%) was reduced.

KEY WORDS: Tween 80, germination, hyphal growth unit (G), Aspergillus carbonarius

RÉSUMÉ: Des études, concernant les effets du Tween 80 sur la germination des spores, la forme et la croissance du mycélium d' Aspergillus carbonarius, ainsi que sur son contenu en proteines, RNA et chitine, ont été enreprises. Des concentrations croissantes de Tween 80 ont pour conséquences : a) une réduction du temps de germination des spores de 24h à 3h ; b) une diminution du diamétre des hyphes et du contenu du mycélium en chitine, ainsi qu'une augmentation de la fréquence des ramifications ayant pour conséquence la formation de « pellets » láches, de grande taille ; c) l'augmentation du poids sec de mycélium et une diminution du contenu (en %) du mycélium en protéines et en RNA

MOTS CLEFS: Tween 80, germination, unité de croissance hyphale (G), Aspergillus carbona- rius.

INTRODUCTION

Several organic compounds [aliphatic acids (mainly unsaturated), alcohols, aldehydes and surfactants] have been found to affect growth, mycelial form and enzyme production (amylase, cellulase, sucrase, ligninase etc.) of many fungi (Takahashi er al., 1960; Fries, 1973; Rao & Rao, 1975; Panda et al., 1987; Asther et al., 1987; Marakis, 1988; Gomez-Alarcon et al., 1989).

Source : MNHN, Paris

26 F. GAITIS

Surfactants, in general, such as Tween 20, Tween 80 etc., modify protein-lipid interactions, solubilize specific proteins and lipids from membranes, lower the surface tension of liquids and alter membrane permeability (Helenius & Simons, 1974).

Since sorbitan polyoxyethylene monooleate (Tween 80) is of great importance in various fungal biotechnological processes because it can stimulate and increase the production and activity of several enzymes (Asther et al., 1987; Gomez-Alarcon et al., 1989) or increase alcohol volumetric productivity in a continuous alcohol fermentation (Torrico & Acevedo, 1988) and as a basic constituent of detergents thrown in the environment (seas, rivers etc.) might affect fungal growth, a study of Tween 80 effects on fungal growth physiology is needed.

Important parameters of fungal growth are: a) the spore germination time, since it determines the lag phase time, b) the morphological form of the mycelium because from changes in the morphology, a whole range of biochemical changes and alterations of culture physical properties take place and c) the protein content, since the produced biomass could be used as animal feed (Marakis, 1988).

To the best of our knowledge there is very little information concerning the effects of Tween 80 on fungal growth physiology. Marakis (1988) observed an increase in mycelium dry weight and total mycelial protein as well as the uptake rate of the carbon and nitrogen sources when Tween 80 (2.5 g/litre) was added in culture media of Rhizopus nigricans and Penicillium frequentans. So far, studies reported by others focus to Tween 80 effects on enzymic productions or activities. Asther et al. (1987) showed ligninase produc- tion by Phanerochaete chrysosporium INA-12 when Tween 80 was supplemented to the culture medium. Gomez-Alarcon et al. (1989) showed a beneficial effect of Tween 80 in increasing yields of various extracellular enzymes of Pycnoporus cinnabarinus.

The aim of this study was to investigate some biochemical and morphological changes induced in Aspergillus carbonarius growing under high Tween 80 concentra- tions.

MATERIALS AND METHODS

Microorganism:

A strain of Aspergillus carbonarius (Bainier) Thom isolated from carob bean storehouse soil (Gaitis, 1995) was used.

Media g I" Components* M T T, Tm T TU Sucrose 20 = 20 20 20 20 Tween 80 = 10 2 5 8 m

* All media contained (g I): (NH;);SO;: 5; KCl: 0.5; MgSO;.7H;0: 0.5; K;HPO,: 1; FeSO,.7 HO: 0.01.

Table 1. Culture media (g I) used for cultivation of A. carbonarius.

Source : MNHN. Paris

Cryptogamie, Mycol. 1998, 19 (1-2) : 25-33 27

Culture media:

For the batch cultures six media were used (Table 1). The pH was adjusted at 5.0-5.5. All culture media were sterilized by autoclaving (15 min, 121°C).

Inoculum preparation:

Peripheral growth zone spores from Czapek-Dox agar cultures were obtained after 5 days of incubation at 30°C. Spores were suspended in quater-strength Ringer’s solution for 1 min in a Waring blender.

Batch cultivation:

А. carbonarius was grown in three 100 ml Erlenmeyer flasks containing 30 ml of medium. These flasks were inoculated with 3x10? spores ml" of medium and incubated at 30°C for 7 days on a rotary shaker (160 rpm).

Spore germination:

Spores were considered to be germinated when their germ tube lengths were one-half of the spore diameter.

Harvesting and drying of biomass:

For the protein, chitin and RNA determination the mycelial mats were harvested by filtration through Whatman No 1 filter paper. Then they were thoroughly washed twice with 25 ml distilled water and freese-dried to a constant weight.

Microscopic observations:

Measurements of hyphal diameter and branching frequency: For microscopic observations, pellets from the cultures were filtered, washed and resuspended for 5 min at 20°C in 0.5N NaOH to separate hyphal clumps. Then the separated hyphae of pellets were placed on slides and measurements were made using a calibrated eyepiece in a Zeiss light microscope (Katz et al., 1972; Morrison & Righelato, 1974).

The hyphal growth unit (G) was determined by the procedure of Trinci (1974):

G= Total length of mycelium (um) Number of tips

Analytical methods:

— Mycelium chitin was determined according to Plassard et al. (1982) method based on the determination of glycosamine by HNO, transforming it into 2:52 anhydromannose; this compound reacts with the 3-methyl-2-benzothiazolone hydrazone

Source : MNHN. Paris

28 F. GAITIS

hydrochloride (MBTH) producing, in the presence of ferric chloride solution an intense blue colour best absorbed at 653nm.

— The RNA concentration was determined by measuring the absorbance at 260nm of a previously HCIO, extracted and KOH digested mycelium (Benthin er al., 1991).

— Protein content was estimated by the method of Gorsuch & Norton (1969).

Statistical analysis:

The data were calculated as the arithmetic mean of 10 replications + standard error of the mean.

RESULTS AND DISCUSSION

Tween 80 effects on the spore germination time, hyphal diameter, hyphal growth unit and morphology of Aspergillus carbonarius are shown in Table 2.

No mycelial growth in medium T, which contained Tween 80 as sole carbon source, was observed. This means that A. carbonarius cannot utilize Tween 80 as carbon source. Our data are in agreement with those of Marakis (1988) and Fries (1973), who reported that the presence of small amounts of aliphatic fatty acids, aldehydes etc., promoting mycelium growth, could not act as nutrients.

Spore germination:

Spore germination time in media containing Tween 80 was 8 times shorter compared to that in medium M without this surfactant. This promotion is probably due to the ability of Tween 80 to promote both uptake and exit of compounds from the cell through modification of plasma membrane permeability (Reese & Maguire, 1969; Mara- kis, 1988).

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floculent masses

Table 2. Effects of Tween 80 on spore germination time, hyphal growth unit (G), hyphal diameter and macroscopic morphology of mycelium (pelletal, filamentous) of A. carbonarius cultured in synthetic liquid media with or without Tween 80.

Source : MNHN, Paris

Cryptogamie, Mycol. 1998, 19 (1-2) : 25-33 29

Mycelial growth:

Mycelium dry weight was increased by 5-20% (depending on Tween 80 concen- tration) compared to the dry weight of medium M (Table 3). Biomass increase might happen because of the alteration of the cell wall permeability resulting in a better nutrient inwards defusion.

The percentage of protein and RNA content was reduced by the presence of Tween 80 as compared to medium M (Table 3). The reduction of the percentage of protein and RNA content cannot be explained as a block of the proteinsynthetic ability of A. carbonarius, but it is most likely that proteins are reduced through solubilization by Tween 80 treatment (Helenius & Simons, 1974). However, this reduction might be due to the distribution of the same amount of proteins and RNA into greater amounts of produced mycelial biomass.

Mycelium morphology:

Hyphal growth unit (G), hyphal diameter, pellet character and chitin content of A. carbonarius were affected by Tween 80 (Tables 2. Thus:

a) The G length measured on young mycelia early in the growth phase and in hyphae in the center and periphery of the pellets after 7 days of incubation, were found to be almost unchanged. The length of G ranged between 64.0 to 112.7 um. A reduction of G length in media T,-T,, with increasing Tween 80 concentrations, was observed. Marakis (1988) found higher G lengths of P. frequentans and R. nigricans in the presence of Tween 80. Thus, the G length should depend on fungal strain and culture conditions.

b) The hyphal diameter was reduced by the presence of increasing concentra- tions of Tween 80 (3.4-2.8 um) as compared to that of medium M (6.6 um). This hyphal thinning can be attributed to the reduction of the chitin content, since the cell wall of A carbonarius belongs to the chitin-glucan group (Bartnicki-Garcia, 1968). In the presence of Tween 80 the hyphal chitin content was lower (4-72%) compared to that determined in hyphae grown in medium M. Chitin content reduction is possibly due to Tween 80 effect on chitin synthetase synthesis or activity.

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Table 3. Tween 80 effects on mycelium dry weight, protein, RNA and chitin contents of A. carbonarius cultured in synthetic liquid media with or without Tween 80.

c) The mycelium in medium M formed dense compact regular pellets (Fig. 1А), whereas under the presence of Tween 80 (media T,-T,) pellets were soft, irregularly shaped and aggregated into loose large floculent masses as shown in Fig. 1B. It is noticeable that

Source : MNHN. Paris

30 F. GAITIS

Fig. 1 — Tween 80 effects on Aspergillus carbonarius. A. Dense, compact, regular pellets produced in medium M. B. Soft, loose, irregularly shaped pellets produced in medium Т. Bar = 2mm.

autolytic process was not observed in the pellet center and consequently no proteins were determined in the culture filtrate.

The reduction of the hyphal diameter resulted in the breakage of hyphae which does not favor the formation of dense compact pellets. Our results, concerning the pellet formation, are not in agreement with those of Righelato (1975) and Marakis (1988) probably because they did not take into acount the hyphal diameter, a factor that can alter the hyphal mechanical resistance (rigidity). It is known that the cell wall of the most fungi

Source : MNHN. Paris

Cryptogamie, Mycol. 1998, 19 (1-2) : 25-33 31

is built up of interwoven microfibrils of chitin cemented by an amorphous matrix material. This structure affords a hyphal rigidity. So, when the skelletal component of the hyphae is reduced, the hyphal rigidity may become weaker resulting in an easier hyphal breakage during agitation of the culture (Gaitis & Marakis, 1994).

CONCLUSION

The reduction of the time needed for spore germination of A. carbonarius in the presence of Tween 80, is a very important result from a practical point of view, since it might contribute to the confrontation of problems (eg. production cost) due to a long lag phase of fungal spores used for the production of a fungal product with biotechnological processes.

The effect of Tween 80 on the germination time of fungal spores, should alert those scientists who are concerned with fungal growth for continuing the use of this surfactant as a soaking agent for the production of inoculum of spores since, even in very low amounts, it reduces the lag phase and generally affects the fungal growth (mycelium production and morphology, protein and RNA content etc.).

The presence of Tween 80 seriously affected the mycelium morphology, which is of considerable importance to the overall physicochemical environment within the fer- menter, affecting this way the quality and production cost of a microbial product. So, the desirable mycelial form could be defined by addition or not of a proper amount of Tween 80 in culture medium.

ACKNOWLEDGEMENTS: The author would like to thank Dr G. Ouzounidou for encouragement and suggestions in preparing the manuscript.

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Cryptogamie, Mycol. 1998, 19 (1-2) : 33-43 33

SCREENING OF ANTIMICROBIAL ACTIVITIES BY AQUATIC HYPHOMYCETES CULTIVATED ON VARIOUS NUTRIENT SOURCES.

G. PLATAS, F. PELÁEZ, J. COLLADO, G. VILLUENDAS and M. T. DÍEZ

Centro de Investigación Básica Merck, Sharp & Dohme de Espana, S. A. Josefa Valcárcel, 38-28027 Madrid (Spain)

Fax 34 1 3210 614 gonzalo-platas@merck.com

ABSTRACT, — Twenty-six strains belonging to 19 species of aquatic hyphomycetes isolated from freshwater streams in Spain were tested for antimicrobial activities after cultivation on 24 different solid media. Fifteen of these cultures produced antibacterial activities and 8 produced antifungal activities in at least one medium. The most succesful media were those with a low nitrogen/carbon ratio. The ecological and biotechnological implications of these results are discussed.

KEY WORDS : antibacterials, antifungals, ingoldian fungi, production media.

RESUME. — Trente six souches de 19 espèces d’hyphomycetes aquatiques, isolées de rivières d'Espagne, ont été testées pour leur activité antimicrobienne sur 24 milieux de culture différents. Quinze de ces souches présentent une activité antimicrobienne et 8 une activité antifongique, sur au moins un milieu. Les meilleurs milieux sont ceux présentant le plus faible rapport azote/carbone. Les implications écologiques et biotechnologiques de ces résultats sont discutées.

MOTS CLEFS : antibactérien, antifongique, ingoldien, milieu

INTRODUCTION

The significant nutritional and environmental differences between aquatic and terrestrial habitats could select for the development of secondary metabolic pathways in aquatic fungi, that differ from those of other fungi. During this last decade, surveys of différent aquatic habitats for novel secondary metabolite producers, have resulted in the identification of several species of fungi that synthesize previously undiscovered biologi- cally active compounds. Some examples of the organisms isolated from different aquatic sources are Microascus longirostris Zukal (Yu et al., 1996) directly isolated from water;

Source : MNHN. Paris

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marine animal parasites or commensals like Phoma sp. (Sugano et al., 1991); fungi isolated from seaweeds like Leptosphaeria sp. (Takahashi er al., 1995a, 1995b), Asteromyces cruciatus F. et F. Moreau ex Hennebert (Shin & Fenical, 1987); or endophytes like Leptosphaeria obiones (Crouan & Crouan) Saccoro (Poch & Gloer, 1989b) and Helicascus kanaloanus Kohlmeyer (Poch & Gloer, 1989a). Most of these organisms were isolated from marine samples, although only some could be considered true marine fungi.

However, other aquatic ecosystems have been less reported or investigated as sources for potential producers of biologically active natural products. This is the case for freshwater habitats and aquatic hyphomycetes, a taxonomically and phylogenetically heterogeneous group of fungi that constitute the dominant group of organisms colonizing deciduous leaves and submerged woods in freshwater courses. It has been reported that this group of organisms is able to produce substances with biotechnological applications, such as enzymes (xylanases, pectinases, proteases, etc.) (Suberkropp, 1992). Nevertheless, although some ecological evidence suggests that members of this group produce diffusible inhibitory substances (Shearer & Zare-Maivan, 1988; Fisher & Anson, 1983), only two active compounds have been fully characterized up to date : kirschsteinin, a cytotoxic compound isolated from Kirschteiniothelia elaterascus Shearer (Poch & Gloer, 1992), and anguillosporal, an antibacterial and antifungal compound isolated from Anguillospora longissima (Sacc. & Syd) Ingold (Harrigan et al., 1995).

Also, the ecological characteristics shared by these aquatic hyphomycetes could make them share their metabolic response to different growth conditions, in spite of their phylogenetic heterogeneity. The goal of the present work is to determine the influence of nutrients on the production of antimicrobial activities by these fungi. The information obtained from these experiments is expected to be applicable to the design of production media to be included in a screening of natural products from aquatic fungi. With this purpose, we selected for this study 26 fungal strains, belonging to 19 species of aquatic hyphomycetes isolated from freshwater streams in several locations in Spain.

To study the influence of nutrients on the production of diffusible antimicrobial compounds, the fungi were grown on 24 different agar media formulated with complex sources commonly used in fungal fermentations. The choice of using these complex sources for this experiment, instead of chemically defined media, is because they usually produce a better yield of secondary metabolites. The production of antimicrobial activi- ties against a representative bacterium (Bacillus subtilis), and a representative fungus (Aspergillus fumigatus) was evaluated after two and four weeks of incubation.

MATERIALS AND METHODS

Fungal strains :

The aquatic hyphomycetes used for this study (Table 1) were monosporic isolates collected from different freshwater streams in Spain, stored at CIBE (Centro de Investi- gación Básica Espana) culture collection. The selection of the cultures to be studied was performed to achieve both a large number of species and a high range of taxonomic variability, as it is shown by the identified teleomorphs.

Source : MNHN, Paris

35

ANTIMICROBIAL ACTIVITIES BY AQUATIC HYPHOMYCETES

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Source : MNHN. Paris

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Cultural conditions :

Plugs of actively growing fungal mycelia, grown on potato dextrose agar (Difco) (0.5 mm?), were placed on the surface of 9 cm diameter Petri dishes containing 20 ml of medium composed by 1% nutrient and 2% agar. Duplicates of these plates were incubated for 2 and 4 weeks respectively at 22°C. The complex nutrient sources tested were : yellow corn meal (Quaker), corn steep liquor (Roquette), pharmamedia (Traders Protein), malt extract, casein hydrolysate, peptonized milk (Oxoid), molasses (Riverton), soy meal, carboxymethylcellulose (Sigma), tomato paste (HUNBS), yeast extract, tryptone, bacio- peptone, beef extract, brain heart infusion, casamino acids, skim milk, potato dextrose broth (Difco), amicase, ardamine, N-Z-Amine E, Hy-Soy (Sheffield), soluble starch (USB) and oat meal (Santivery). k

Antimicrobial activity assays :

Antibacterial assay. The antibacterial assay Petri dishes were prepared with 10 ml of melted nutrient agar (Difco) inoculated with Bacillus subtilis (0.5 ml of a spore suspension (Difco) per 1 liter of melted nutrient agar (Difco) cooled at 45°C)

Antifungal assay : The antifungal Petri dishes were prepared with 10 ml of melted YNB-D medium (dextrose 1%, yeast nitrogen base (Difco) 0.7% and agar 1.5%), cooled at 45°C and inoculated with a titrated spore suspension of Aspergillus fumigatus Fres. ATCC 13073. The final concentration of spores was 5 x 10° spores/liter.

To perform the antimicrobial tests, 8 mm diameter agar plugs were cut from plates with hyphomycetes after 2 and 4 weeks of incubation, and placed over the surface of the assay plates, and were incubated overnight at 37°C. The diameter of the inhibition zone around each agar plugs was recorded.

RESULTS

Fifteen strains, belonging to 11 fungal species, produced antibacterial activity under at least, one cultivation condition (Table 2). The production of antifungal activities was not as frequent, being observed in 8 strains belonging to 6 fungal species (Table 3). Both antibacterial and antifungal activities were detected with 5 strains :Dendrospora tenella, Gyoerffyella sp., Tumularia aquatica ED 31 and FP 148 and Varicosporium elodeae FP 2. In one case, Gyoerffyella sp., the inhibition of both target strains was detected under the same cultural conditions, suggesting the presence of a single activity with both antibacterial and antifungal properties, or a common stimulation of the production of several agents. The tested strains of A. acuminata, A. tetracladia, Fillosporella sp., H. stellata, T. curvisporum and T. splendens, did not produce antimicrobial activities in the conditions studied.

The data suggest that both types of antimicrobial activities are released at different incubation times; 77% of the 63 antifungal activities were detected at 2 weeks, being 35 activities detected both at 2 and 4 weeks. However, only 48% of the 82 antibac- terial activities detected were shown at 2 weeks, being 30 of them also observed at 4 weeks. Assuming that the detection of these antimicrobial activities at 2 time periods is due to the

Source : MNHN. Paris

2f

ANTIMICROBIAL ACTIVITIES BY AQUATIC HYPHOMYCETES

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Source : MNHN. Paris

С. PLATAS et al.

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Source : MNHN. Paris

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ANTIMICROBIAL ACTIVITIES BY AQUATIC HYPHOMYCETES

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Source : MNHN. Paris

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Figure 1. — Number of hyphomycete strains having antimicrobial activities when cultured in a single nutrient.

action of the same active agent(s), this result could suggest either that the antimicrobial compounds produced were relatively stable, or that they were being continuously synthe- sized along the whole course of the incubation

Although the production of antimicrobial activities in all the hyphomycetes tested is not induced by a given complex source, some of them, such as potato dextrose, molasses, malt extract and soluble starch, were especially useful (Fig. 1). These media share a low nitrogen/carbon ratio, characteristic of traditional fungal media. Nevertheless, other nutrient sources with a higher nitrogen /carbon balance such as beef extract or skim milk also supported the production of biological activities in a considerable number of strains.

Source : MNHN, Paris

ANTIMICROBIAL ACTIVITIES BY AQUATIC HYPHOMYCETES 41

The conditions and ability for the production of antimicrobial activities varied among strains of the same species. For example, in the three strains of A. crassa, the number of sources that stimulate the production of the antibacterial activity in FP 48, FP 154 and FP 216 were 6, 12 and 1, respectively.

The production of antimicrobial agents in response to the different media by the aquatic hyphomycetes studied, was very variable. For instance, 7. setigerum and T. elegans produced antibacterial activities only under one condition. Dendrospora tenella, Flagel- lospora sp., Gyoerffvella sp. and И elodeae ЕР 2 produced these activi in carbohydrate enriched media such as malt extract, molasses and soluble starch. Finally, some fungi such as H. lugdunensis or species of the genus Tumularia produced antimicrobial activity when grown in several sources with no related ingredients.

DISCUSSION

The production of diffusible antibiotic substances is a widely distributed cha- racteristic among fungi. Although it is difficult to infer the role of these compounds in natural environments or if they occur at all, they could provide an ecological advantage in the immediate micro habitats of the producer organisms by defending its nutritional or positional resources from other competitors. Theoretically, this statement may be less applicable to aquatic environments, because of the ecological ineffectiveness of a com- pound that is constantly removed by water. Therefore, although aquatic hyphomycetes most likely persist in twigs and leaves that are exposed to terrestrial environments, the ecological preeminence of a fungus able to produce antibiotics in aquatic systems is not so obvious. In any case, the ability of several aquatic hyphomycetes to produce these compounds has been shown previously (Shearer & Zare-Maivan, 1988; Fisher & Anson, 1983), and has been also extensively observed in this work.

The substrates inhabited by this group of fungi, deciduous leaves and submerged woods, due to their lignin enriched composition are hypothetically more susceptible to fungal rather than to bacterial colonization. For that reason, as the major competitors of these organisms in nature should be other fungi, aquatic hyphomycetes would be expected to produce a fungal rather than a bacterial inhibition. However, in the survey presented in this work, from 19 fungal species tested, 11 appear to produce bacterial inhibition and only 6 produce antifungal compounds. Although the extrapolation of these observations to the real interactions of these fungi in natural environments could be undoubtfully questioned, these data may suggest the importance of bacterial-fungal interactions in the colonized wood habitat. The release of an antibacterial agent could limit the consumption by bacteria of the sugars and other nutrients liberated by the extracellular enzymatic machinery of the fungi (cellulases, xylanases, pectinases, etc.).

Antifungal agents not only interfere with the growth of other hyphomycetes but also affect the viability of yeasts. Yeasts, like bacteria, are commonly found in freshwater courses, have high growth rates, and could behave as opportunistic commensals of the substances liberated by them. It has been reported that wood blocks colonized by Tumularia aquatica (syn. Massarina aquatica) were able to inhibit the growth of the yeast Sporobolomyces roseus (Fisher & Anson, 1983). The 2 different strains of Tumularia aquatica studied in this work also produced an antifungal activity that caused the inhibition of Candida albicans (data not shown), together with an antibacterial agent, whose production did not always coincide with the detection of the antifungal activity.

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42 С. PLATAS et al.

Heliscus lugdunensis, a species from submerged twigs and leaves, produced an antifungal activity Shearer & Zare-Maivan (1988), studying the in vitro interactions among different fungi from freshwater habitats, have suggested that this species might not be able to inhibit growth of invading species or to defend captured resources. We observed antifungal activities in the two H. lugdunensis strains studied, FP 138 and FP 373. These data do not agree with the above mentioned suggestion, perhaps because their competition experiments were performed on corn meal agar, medium in which we were also unable to detect the antifungal activity produced by this organism (Table 3). Also, it has to be considered that the production of the antifungal agent shows strain-to-strain variations, as evidenced by the fact that from the sixteen cases in which an antifungal activity appeared, only 8 were common between both isolates. The potentially different suscepti- bility of A. fumigatus and the aquatic hyphomycetes studied by Shearer & Zare-Maivan to the antifungal compound, could also contribute to explain the different results.

As mentioned above, 5 strains inhibited both target organisms. However, the number of these antimicrobial activities could be higher, because the detection of an antimicrobial activity is related to the concentration tested and, also, to the susceptibility of the target strain to the active agent(s). As an example, anguillosporal from Anguillos- pora longissima (Sacc. & Syd.) Ingold (Harrigan et al., 1995) is able to inhibit both bacteria and fungi, with MIC values of 4 ug/ml against Staphylococcus aureus and 58 ug/ml against Candida albicans. The ecological impact of a broad spectrum antibiotics in natural conditions is unknown. However, in terms of metabolic economy, it may be considered that the synthesis of a general inhibitor could be less expensive than the production of several specific compounds.

This work has also shown the heterogenous behavior of this group of fungi with regards to the conditions required for antibiotic production. Based on this aspect, the hyphomycetes studied could be divided in four groups : i) fungi producing the antimicro- bial activity selectively in media with a very low nitrogen/carbon balance (malt extract, molasses, soluble starch or potato dextrose), such as D. tenella, Gyoerffyella sp., V. elodeae FP 2, and Flagellospora sp.; ii) fungi that produce the antimicrobial activity only in media with a high nitrogen/carbon balance, (A. crassa FP 216, ED 61 and Hyphomycete 1); iii) fungi whose antimicrobial activity production is less dependent of the nitrogen/carbon balance like, Н. lugdunensis, T. aquatica, T. tuberculata, A. crassa FP 48, FP 154 and M. aquatica ; iv) finally those fungi that produce their antimicrobial activities specifically in plant derivatives such as pharmamedia or corn steep liquor, (T: setigerum, T. elegans and V. elodeae FP 164). The observation of these activities in these non-overlapping circums- tances could be related to the presence of specific precursors of the active substance(s) in these media, as it was reported for the synthesis of penicillin G by Penicillium chrysogenum (Mead & Stack, 1948).

The production of the antimicrobial activity was neither associated with the growth level of the fungi on each specific substrate, nor with the ability to synthesize degrading enzymes such as cellulases or proteases (data not shown). However, these optimum conditions for antibiotic production could be hypothetically related to the degree of specificity of fungi for colonizing a given substrate, or for determining their role during the ecological succession of fungi in the decomposition of the plant substrates.

This work has shown that aquatic hyphomycetes are a potential source of uncharacterized bioactive compounds. To obtain a maximum information on the meta- bolic potential of these fungi, several media with different nitrogen/carbon balance should be applied, rather than different media with a low nitrogen/carbon balance, as it has been traditionally used (Poch & Gloer, 1992; Harrigan et al., 1995). Other physical variables not

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ANTIMICROBIAL ACTIVITIES BY AQUATIC HYPHOMYCETES 43

considered in this work, such as temperature or pH, might also influence the production of these still uncharacterized compounds.

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Source : MNHN. Paris

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SUR LES RELATIONS 1 ENTRE UN BASIDIOMYCETE DE ROND DE SORCIERE, LEUCOPAXILLUS GIGANTEUS, LA MICROFLORE DU SOL ET LES VEGETAUX SUPERIEURS.

Paul KAISER *

INA-PG Microbiologie 78850 THIVERVAL-GRIGNON FRANCE

* adresse actuelle : 12 bis rue de Porto-Riche 92190 MEUDON

ABSTRACT : Leucopaxillus giganteus developped as fairy rings in an acid grassland. According to the climatic conditions the spreading of the fairy ring ranged from 25 to 60 cm each year and occured at the end of the winter and the early spring. Fructification occured between september and october. Mycelium grew around the stolons and the roots of the grassand plants which were destroyed. The pH of the invaded soil raised due to a high ammonia level but the content of organic carbon and the CIN ratio was lowered. The Leucopaxillus mycelium enhanced the mineralization of organic carbon and nitrogen, the decomposed organic matter was partially humified. Concerning enzymatic activities of the invaded soil a decrease of the urease and an enhancement of the desaminases and pectinases activities was noticed. Supplementation in glucose or reducing sugars from root exsudates specifically stimulated the oxygen uptake of the invaded soil. In the latter the moulds were in great part eliminated but the number of the other soil microorganisms was only weakly affected. In vitro the Leucopaxillus mycelium inhibited the growth of bacteria and actinomycetes but not the moulds. Mycelium growth of Leucopaxillus on sterile and non sterile soil showed that the microflora exerted a strong inhibitory action against the Leucopaxillus. The inhibition diminished at low temperature. In pure culture Leucopaxillus mycelium developped well at +4° C whereas the major part of moulds and bacteria did not. It appeared that the Leucopaxillus needed two conditions for growth in soil : A biological void and an adapted nutrient. Low temperatures of the winter create the biological void. Root exsudates and bacterial polysaccharides of the roots could be the nutrient. /n vitro the Leucopaxillus developped on bacterial mats but not on mould mats. It used well semi-synthetic media for growth. Best nitrogen sources were peptones, numerous simple sugars and polysaccharides could be used.

KEY WORDS : Leucopaxillus giganteus, soil biochemistry and microbiology, Phanerogams.

RESUME : Leucopaxillus giganteus se développe en cercles dans une prairie acide où il avance de 20-60 cm chaque année. il croit autour des racines des phanérogames qui sont détruits et augmente la minéralisation du carbone et de l'azote organique. Les moisissures du sol sont, en grande partie, éléminées alors qu'in vitro, ce sont les bactéries et les actinomycètes qui sont inhibés. La microflore du sol exerce une action inhibitrice sur le développement du Leucopaxillus et celui-ci ne peut se propager qu'à la fin de l'hiver quand il ya un vide biologique. Le basidiomycète se multiplie bien au laboratoire sur des milieux peptonés semi-synthétiques et utilise une grande variété de glucides.

MOTS CLE

S : Leucopaxillus giganteus, biochimie et microbiologie du sol, Phanérogames.

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46 P. KAISER

INTRODUCTION

Il n'existe pas un mycologue qui n'ait observé, ici ou là, la forme annulaire qu'affectent quantité de mycéliums de champignons supérieurs, les uns dans les prés, visibles de tout temps à cause de l’herbe plus verte ou morte qui les dessine et, ceux des forêts, décelables au moment de la production de sporophores (Becker, 1990). Pour Fenwick (1976), les cercles peuvent être causés par 50 espèces de champignons. Très tôt, les mycologues se sont intéressés à la physiologie de ces anneaux (« ronds de sorcières »). Molliard (1910, 1925) mesurait l'accumulation d'ammoniaque dans la zone de croissance de Marasmius oreades (Bolt. : Fr.) Fr. et indiquait son rôle phytotoxique.

Hollande (1945) étudie la clitocybine, antibiotique excrété par Leucopaxillus giganteus (Leysser : Fr.) Singer (Clitocybe maxima) et constate que ce champignon détermine, dans les prairies alpines de 900 à 1400 mètres, la formation d’anneaux dont l'herbe est morte et peu putrescible. 11 pense que le champignon, en se développant, tue l'herbe et doit élaborer un principe actif inhibant la multiplication des microbes nécessai- res à la putréfaction des végétaux.

Couderchet (1967) reprend le travail sur un anneau dû à Lepista personata (Fr. : Fr.) W. Smith et constate une accumulation d’ammoniaque dans la zone dénudée, une élimination des moisissures et une inhibition des bactéries nitrifiantes.

Norstadt et al. (1973) notent la pauvreté de l'activité uréase d'un sol infesté de Marasmius oreades. Ces résultats prouvent que la multiplication d’un champignon supé- rieur provoque des changements physico-chimiques du sol, entraînant des variations importantes de la croissance herbacée et microbienne.

D'autre part, comme l’a montré Gramss (1981, 1985), les Basidiomycètes subis- sent, de la part du sol, un fort antagonisme.

Nous avons repris ces recherches sur deux anneaux dûs à Leucopaxillus giganteus situés dans une prairie acide de Jouy en Josas aux Metz (Yvelines) en analysant, d'une part l'effet du Basidiomycète sur l'évolution physico-chimique et microbiologique du sol infesté et, d'autre part, l'impact de la microflore autochtone sur sa croissance.

MATÉRIELS ET MÉTHODES

- Dénombrement des groupes microbiens du sol : Pochon & Tardieux (1962).

— Analyses physico-chimiques :

pH : 5 g de sol + 5 g d'eau distillée ; mélange et mesure au ph-metre.

C, N : Doseur automatique Hewlett-Packard

NH4+ : méthode colorimétrique de Hoffmann & Teicher (1961).

МОЗ — : méthode à l'acide chromotropique selon Sims & Jackson (1971).

Humidité : balance à humidité

Acides humiques : selon Pochon & Tardieux (1962).

HCN : papiers filtres imprégnés d'une solution contenant du carbonate de soude à 2,5 % et de l'acide picrique à 0,5 % (réactif de Guignard in Lebeau & Hawn (1963).

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LEUCOPAXILUS GIGANTEUS 47

— Enzymes : Uréase, Désaminases : méthode de Hoffmann & Teicher (1961). Phosphatase : méthode de Hoffman (1967). Pectinases : méthode de Kaiser & Monzon (1972).

— Respiration : CO2 in situ : méthode de Bachelier (1973). Absorption de l'oxygène : Appareil de Warburg selon Umbreit et al. (1964).

— Antagonisme de la terre : technique de Pink (1961)

— Activité antagoniste : Leucopaxillus giganteus est cultivé sur boîtes de gélose malt- peptone (extrait de malt : 10 g/l ; bactopeptone Difco : 2 g/l). Des carrés de mycélium de 1 cm de côté sont découpés et placés sur des géloses asparagine-glucose (Pochon & Tar- dieux, 1962) préalablement ensemencées avec des souches pures ou des suspensions- dilutions de terre.

— Culture de Leucopaxillus giganteus :

Milieu semi synthétique : eau déminéralisée 11 ; phosphate monopotassique 1g ; sulfate de magnésium 0,5g ; chlorure de calcium 0,1g ; chlorure de sodium 0,1g ; solution d'oligoéléments 5ml ; solution de vitamines 0,5ml ; bactopeptone (Difco) 5g ; pH 6,0. Les glucides sont ajoutés à raison de 2g/l.

Solution d'oligoéléments (en g/l) : éthylénediaminetrétacétate sel disodique 1,7 ; sulfate de fer ferreux 1,0 ; sulfate de manganèse 0,3 ; acide borique 0,1 ; sulfate de zinc 0,05 ; sulfate de cuivre 0,05 ; molybdate d'ammonium 0,05 ; nitrate de cobalt 0,05 ; sulfate de cadmium 0,05

Solution de vitamines (en mg/100ml) : B12 2 ; thiamine 100 ; biotine 2 ; panto- thénate de calcium 2.

— Milieu pour plantules (en mg/l) : nitrate de calcium 750 ; nitrate de potassium 450 ; sulfate de magnésium 260 ; phosphate monopotassique 136 ; solution d'oligoéléments (ci-dessus) 10ml.

= Préparation des sucres réducteurs provenant de la rhizosphere des plantes de prairies :

Les racines et le sol rhizosphérique attenant sont lavés dans un mélange éthanol- eau (30 : 70).

Le liquide de lavage est clarifié par centrifugation puis concentré. Il est alors passé sur résine cationique, puis sur résine anionique. Le liquide résiduel contenant les sucres est concentré à sec puis repris par 2ml d'eau distillée. Les sucres réducteurs sont dosés par la méthode de Somogyi-Nelson (Nelson, 1944).

RÉSULTATS ET DISCUSSION Description de la prairie

. , П s’agit d'une prairie à sol acide, (voir tableau 1 pour les données physico- chimiques) régulièrement tondue et comportant de nombreux types de plantes herbacées.

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48 P. KAISER

Fig. 1 — « Rond de sorcière » à Leucopaxillus giganteus dans une prairie acide de Jouy en Josas (78) au mois de septembre.

Nous y avons déterminé : Festuca rubra, Holcus lanatus, Agrostis vulgaris et A. stolonifera, Anthoxanthum odoratum pour les Graminées ; Lotus corniculatus, Orobus tuberosus, Tri- folium spp. pour les Légumineuses ; Hieracium pilosella, Achillea millefolium, Centaurea jacea, Chrysanthemum segetum, Picris hieracioides pour les Composées ; Plantago lanceo- lata, Carex glauca, Luzula campestris, Calluna vulgaris, Brunella vulgaris pour ne nommer que les principales espèces d’autres familles.

Croissance in situ de Leucopaxillus giganteus

Dans le sol, le nouveau mycélium apparait début mars, à la fin de l'hiver. Soit il est déjà visible macroscopiquement au niveau des stolons et des radicelles, soit le sol autour des racines se décolore, ce qui annonce son apparition massive. À cette époque, les plantes ne sont pas encore détruites. Le mycélium croît à 5-10 cm de la zone de dévelop- pement de l’année précédente, laissant intacte une bande de prairie entre l’ancienne et la nouvelle zone. Nous n'avons pu trouver de mycélium reliant ces deux zones. Au cours du mois d'avril, le dépérissement des plantes de prairies envahies par le mycélium se manifeste sous forme de plaques jaunes, irrégulieres et discontinues, disposées en une ligne presque droite ou un léger arc de cercle dont il est difficile d'évaluer le diamètre. Les plaques de pelouse détruite ont une largeur de 15 à 30 cm, parfois 50 cm lorsque le printemps est froid et humide et une longueur comprise entre 15 et 100 cm (figure 1).

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LEUCOPAXILUS GIGANTEUS 49

Fig. 2 — Profil du terrain au niveau de la couronne mycéfienne en avril. A gauche, terre témoin ; à droite, terre envahie par le mycelium du Zeucopaxillus giganteus. Les stolons et radicelles des plantes sont enrobés de mycélium, la terre est décolorée.

En mai, les plantes envahies meurent et on remarque que le mycélium a poussé dans la zone des stolons et des radicelles sur quelques cms de profondeur (figure 2).

La terre envahie est décolorée par rapport à la terre non colonisée. Les stolons et racines des plantes sont complètement pourris, l'écorce est digérée, brune ; il ne subsiste qu'un cylindre central. Stolons et racines ont été pratiquement asphyxiés par l'important développement du mycélium qui les recouvre d'un dense feutrage blanc. C'est seulement plus tard, dans le courant du printemps, que le mycélium colonise les couches profondes (15 cm) du sol. La production de sporophores a lieu en septembre ou octobre. Les sporophores se situent alors à la périphérie des zones dénudées (figure 1) ; l'année suivante, elles seront recolonisées ; d'abord, par les plantes tragantes en surface : Hieracium pilo- sella, Achillea millefolium puis, progressivement, par des plantes à racines plus profondes. Le mycélium disparait petit à petit des zones qu'il a colonisées et la végétation devient luxuriante.

Notre champignon fait chaque année une avancée centrifuge comprise entre 25 et 60 cm. Couderchet (1967) note une avancée moyenne annuelle de 50 cm en 12 ans avec Lepista personata mais la distance entre la 11* et 12* année est de 130 cm. Pour Agaricus arvensis J. C. Sch. : Fr., Edwards (1984) donne une moyenne de 42 à 49 cm par an. Ces trois espèces présentent une progression comparable et irrégulière d'une année à l'autre. Dans le cas de Lepista personata, Couderchet (1967) a nettement observé la prolifération cen-

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50 P. KAISER

Leucopaxillus Témoin

72 T 73 72 pH 5,1 5,0 4,5 4,4 C% 42 4,8 5,2 5,5 N% 0,15 0,45 0,08 0,33 CN 28 10,6 65 16,6 ac. humiques g/Kg 10,5 2 78 E N-NO3 mg/100g 1,6 = 0,5 E

N-NH4 mg/100g 42

Tableau 1 — Analyses physico-chimiques de la terre à Leucopaxillus giganteus et de la terre témoin en novembre 1972 et 1973.

trifuge du mycélium à la surface de la terre, reliant ainsi l'ancien cercle au nouveau. Nous n'avons jamais pu relever un tel phénomène : avec Leucopaxillus, aucun mycélium n'appa- raît entre l’ancien et le nouveau cercle, que ce soit en profondeur ou en surface. Il est donc possible que ce champignon progresse grâce à ses spores. Toohey (1983), qui a observé 31 espèces de champignons de ronds de sorcière, pense que les spores sont responsables de la formation de nouvelles colonies. Cependant, une fois en janvier, nous avons décelé, à un endroit situé en bordure de l’ancien cercle, un développement de mycélium juste au niveau des stolons et des racines. Shantz et Piemeisel (1917) ont reconnu trois types d’anneaux selon leur action sur les Phanérogames. Le type 1, auquel appartient Leucopaxillus, comprend les mycéliums tuant ou endommageant sérieusement la végétation. Leucopaxil- lus a une affinité particulière pour les racines et les stolons qu'il colonise en premier. On peut sûrement le classer comme un pathogène des plantes de prairies. Gramss (1981) constate la dépendance de quelques Basidiomycètes vis-à-vis des racines des plantes cultivées et Poppe (1970/1971) (in Gramss, 1981) suggère que les racines vivantes des végétaux de prairie constituent une niche écologique pour le développement du mycélium des espèces d’ Agaricus. Smith (1980) considère Marasmius oreades comme un parasite des racines.

Analyse physico-chimique de la terre des anneaux

La zone externe (T) non envahie a été comparée à l’anneau envahi par le mycélium de Leucopaxillus giganteus (Lg) (analyses effectuées en novembre, tableau 1).

Nous mesurons dans la zone Lg une élévation du pH, düe à une forte augmen- tation du taux d'azote ammoniacal. Aussi, le taux d'azote total dans Lg est-il plus élevé et le rapport C/N plus bas. Dans la zone à mycélium, il y a un peu moins de carbone organique mais davantage d’acides humiques. La minéralisation accentuée du carbone et de l'azote dans la zone à Lg va de pair avec une humification accentuée de la matière organique décomposée. Grunda (1976) a noté, pour d’autres Basidiomycètes, une éléva- tion du taux des acides humiques. Ces résultats démontrent aussi que la décoloration de la terre par Leucopaxillus n’est pas le résultat d’une élimination des acides humiques. Elle dépendrait de l'excrétion d’acides organiques par Leucopaxillus. Nous avons vérifié que l'acide citrique décolore les acides humiques et que Leucopaxillus excrète des acide

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LEUCOPAXILUS GIGANTEUS 51

LG Uréase (ugN-NHa/g terre/heure) 33 désaminase (ugN-NH4/g terre/heure) Aspartate 0 Proline 2] Glycine 0,4 Glutamate 1,6 Leucine 1,9 Alanine 3,1 Arginine 2,6 Ornithine 17 Phosphatase acide (ug phenol/g terre/heure 30 Pectinelyase (ug sucres réducteurs/g/heure) novembre 52 mai 120

Tableau 2 — Activité enzymatique des sols à Leucopaxillus giganteus (Lg) et témoin (T) en novembre 1972.

organiques dans les milieux de culture au laboratoire : les milieux sont fortement acidifiés apres la culture. Plusieurs auteurs dont Edwards (1984) et Couderchet (1967) mentionnent une décoloration de la terre envahie par le mycélium des Basidiomycètes. Dès 1910, Molliard relate une forte augmentation de l'ammoniaque dans les zones à mycélium de Marasmius, fait confirmé par Couderchet (1967) pour le Lepista. Cet auteur note aussi une augmentation de l'azote nitrique, ce que nous avons également observé. La diminution de la matiére organique a été établie par Edwards (1984) sur des anneaux à Agaricus et confirme nos données. Grunda (1976), en comparant le sol témoin avec des sols envahis par trois types de Basidiomycétes, constate un abaissement du pH et du taux de calcium, une élévation du taux de N, P, K solubles alors que Fisher (1977) montre une diminution de N et P extractibles dans les sols oà Marasmius oreades est passé. On peut donc conclure que le développement massif des mycéliums de Basidomycétes stimule fortement la minéralisation du carbone et de l'azote organiques du sol. Dans notre cas, une partie de la matiére organique décomposée est humifiée.

Nous avons dosé l'activité de quelques enzymes (tableau 2). La terre à Lg contient moins d'uréase, ce qu'ont déjà constaté Norstadt et al. (1973) pour les anneaux à Marasmius oreades. L'urée ne semble pas constituer un bon substrat azoté pour ces champignons. Par contre, la terrre à Lg est plus riche en désaminases diverses, excepté pour la glycine-désaminase. Les acides aminés constituent donc de bonnes sources d'azote pour Lg et sont facilement minéralisés, d'ou le taux élevé en ammoniaque retrouvé dans les anneaux.

Les enzymes pectinolytiques (pectinelyase) ainsi que la phosphatase acide refle- tent l'activité biologique globale (Kaiser & Monzon de Asconegui, 1972 ; Domsch et al., 1979). Elles ont une activité sensiblement égale pour les terres à Lg et le témoin. On remarque cependant une activité plus forte pour Lg en mai et moindre en novembre. Nous avons mesuré la respiration des deux terres au moyen de deux méthodes : le dégagement de gaz carbonique et l'absorption de l'oxygène. Dans l'ensemble, le taux de CO2 dégagé s'élève pendant l'été et diminue au fur et à mesure que la saison se refroidit, puis le dégagement reprend vers le printemps. En début d'été, la respiration est semblable dans la

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52 Р. KAISER

DATE Lg 18 juillet 635 20 septembre 469 9 novembre 127

13 mars

Tableau 3 — Dégagement de gaz carbonique en mg de C-CO2/m2/heure dans les anneaux de Leucopaxillus giganteus (Lg) et dans les terres témoin (T) en 1973 et 1974.

terre à Leucopaxillus et la terre témoin mais, à la fin de la saison, le dégagement devient trois fois plus intense dans l'anneau à Leucopaxillus (tableau 3). Edwards (1984) a décrit un phénomene similaire pour Agaricus arvensis. Ces mesures indiquent que la minéralisa- tion du carbone organique est plus intense dans les anneaux à Leucopaxillus, ce qui ressortait déjà au vu des valeurs de carbone organique mesurées dans ces terres (voir plus haut). L'absorption de l'oxygene ne va pas dans le méme sens que celui du dégagement de СО? mais les dosages ont été réalisés à une époque différente. Dans l'ensemble, la terre à Leucopaxillus absorbe beaucoup moins d’oxygene que la terre témoin (tableau 4). Avec l'addition de glucose, l'absorption d’oxygene se trouve fortement stimulée pour la terre à Leucopaxillus et, dans des proportions moindres, pour la terre témoin : par exemple, en novembre où l'absorption est particulièrement faible, l'addition de glucose l'augmente de 10 fois dans le cas de Leucopaxillus et seulement de 1.4 fois avec le témoin. En juin, l'augmentation est de 4,5 fois pour Leucopaxillus et de 1,8 avec pour le témoin. Les sucres réducteurs extraits des exsudats de racines de prairie ont un effet identique. On peut donc penser que, par rapport à la terre témoin, la terre à Leucopaxillus contient une plus forte biomasse, celle-ci souffrant d'un manque de glucides aisément assimilables, surtout à la fin del'automne. Ce fait a été confirmé par des analyses radio-respirométriques effectuées раг le professeur J. Mayaudon (Communication personnelle). Ce dernier a mélangé aux deux sols prélevés en septembre du glucose UI4C et 114C. L'activité du sol à Leucopaxillus n'est que de 2 à 3 % par rapport aux 100 % du sol témoin. Ces différences expliqueraient en partie l'envahissement progressif du Leucopaxillus dans la prairie. On sait, en effet, que les racines des végétaux supérieurs excrétent des sucres et des acides aminés en fortes quantités, spécialement au printemps et lors des fortes luminosités (Vancura & Kunc, 1988). Le Leucopaxillus profiterait de ces excrétions radicellaires pour avancer dans la prairie. Sullia (1973) a montré que des extraits racinaires stimulaient fortement la crois- sance des moisissures rhizosphériques.

Novembre Juin

Ë 20 86

Lg 3,6 24 T + 4 mg de glucose 30 161 Lg + 4 mg de glucose 36 108 T +4 mg de sucres réducteurs* - 121 Lg + 4 mg de sucres réducteurs* E 66

* sucres réducteurs issus des exudats de racines de prairie

Tableau 4 — Absorption de l'oxygène en yl dO2/g de terre/heure dans les anneaux de Leucopaxillus giganteus (Lg) et dans le témoin (T) en 1973 et 1974.

Source : MNHN, Paris

LEUCOPAXILUS GIGANTEUS 53

[ Novembre | Novembre Février M Juin | 197 1973 1974 1974 1974 Moisissures Lg 0,8 30 1 80 30 T 280 4300 350 290 1400 Actinomycètes Lg 800 900 50 2900 2000 Ih 1100 3300 2400 3200 29000 Bacteries Lg 750 1000 1900 19000 16000 T 300 2600 625 7100 108000

Tableau 5 — Analyse microbiologique de la terre envahie par Leucopaxillus giganteus (Lg) et de la terre témoin (T). Nombre de moisissures, d'actinomycétes et de bactéries en milliers/g de terre, en 1972, 1973 et 1974.

Analyse microbiologique de la terre des anneaux

Nous avons calculé le nombre de différents groupements de microbes du sol selon la méthode de Pochon et Tardieux (1962). Deux échantillons sont prélevés: l'un dans la zone dénudée à Leucopaxillus, l'autre dans la terre témoin externe où le Basidiomycète n'a jamais poussé (Tableau 5).

Les moisissures subissent le recul le plus net. Elles se trouvent en nombre très inférieur dans la zone à Leucopaxillus mais ne disparaissent jamais complètement. Il subsiste des Trichoderma viride, des Mucor, des Fusarium (F. culmorum) et d’autres espèces. D'amples variations de nombre dépendent de l'année du prélèvement et de la saison. Warcup (1951) et Couderchet (1967) ont constaté le même phénomène pour d'autres Basidiomycètes. Comment les moisissures sont-elles éliminées ? Certainement pas par une substance inhibitrice comme la clitocybine puisque Hollande (1949) la déclare inactive sur les moisissures mais de préférence, comme le pense Couderchet, par compé- tition nutritionnelle.

Le nombre d'Actinomycétes connait de profondes fluctuations suivant les pré- lévements. Ils sont légèrement inhibes, sauf une fois en février où la zone à Leucopaxillus n'en possède presque plus et en mai où les deux valeurs sont égales.

L'ensemble des bactéries hétérotrophes aérobies subit, en général, une faible baisse dans les anneaux, excepté deux fois, en février et en mai, quand il y a stimulation. Peut-étre est-ce dü, en février, à la suppression de l'action antagoniste exercée par les Actinomycétes. Couderchet (1967) note également une inhibition, plutot indirecte, du Lepista sur la microflore bactérienne et, selon Melin er al. (1947), certaines espéces de Marasmius sont des producteurs actifs de substances antibactériennes.

Antagonisme du Leucopaxillus giganteus in vitro et in vivo

L'activité antibiotique de Leucopaxillus giganteus (s. n. Clitocybe gigantea variété candida) a été démontrée, dés 1945, par Hollande (1945, 1947) puis par Riviere er al. (1947). Ce champignon produit un antibiotique à large spectre puisqu'il inhibe et tue toutes les souches de bactéries Gram- et Gram- ainsi que le bacille tuberculeux.

Source : MNHN. Paris

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Souches testées diamètre d'inhibition (mm) Klebsiella pneumoniae 16 net Escherichia coli 548 14 net. Bacillus mycoides T4 16 net |Micromonospora globosa lére lecture 25 net 2nde lecture 12 peu net Actinomycète n°1 lere lecture 23 net 2nde lecture 15 peu net Actinomycéte n°2 19 net Actinomycéte n°3 26 net Actinomycète n°6 21 net Penicillium sp. 0 Penicillium sp.2 10u0 Mucor sp. 20u0 Trichoderma sp. il 1

Tableau 6 — Activité antagoniste de Leucopaxillus giganteus sur diverses souches de bactéries, d'Actinomycétes ou de moisissures. Diamètre de la zone d'inhibition en mm.

Nous avons prouvé à nouveau, avec une culture pure de Leucopaxillus provenant de spores, que ce champignon est antagoniste d'une grande variété de bactéries Gram+ et Gram — et de diverses souches d' Actinomycétes (tableau 6 et figure 3). La souche isolée de spores est beaucoup plus active que celle provenant d'un fragment du chapeau. Nous avons de méme trouvé une action antagoniste avec du mycélium prélevé in situ, dans la terre de prairie. Le Basidiomycete semble trés peu actif sur les moisissures, voire méme sans effet ; pour Hollande (1945), la clitocybine n'a aucune action sur elles. Avec plusieurs souches, nous avons observé une absence ou un trés léger antagonisme.

La terre envahie par le mycélium du Leucopaxillus est exempte d'activité anta- goniste. Selon la technique de Pink (1961), la terre a été séchée, broyée et placée dans de petits cylindres, en surface de la gélose. Nous avons élué avec des tampons de pH acides et alcalins : aucune activité antagoniste ne fut décelée autour des cylindres. Ce résultat concorde avec celui obtenu par Riviere er al. (1947) : aprés absorption sur charbon, alumine ou différentes argiles, pas un procédé d'élution ne permet de récupérer la clitocy- bine ; cet échec tiendrait à une dénaturation de la protéine. On peut donc penser que, dans le sol in situ, seuls sont inhibés ou tués les bactéries ou les Actinomycétes qui se trouvent directement au contact du mycélium. A l'intérieur des grains de terre dépourvus de mycélium du Basidiomycéte, une activité bactérienne normale est à prevoir.

Causes de la toxicité du Basidiomycète sur les phanérogames de la prairie.

Le Leucopaxillus fait partie du groupe des basidiomycetes qui detruisent les phanérogames des prairies (groupe 1) et nous nous sommes demandé quels facteurs léthaux pouvaient étre en cause. Deux expériences ont été réalisées. Dans la premiére, nous avons mélangé en quantités égales des extraits de terre envahis par le Leucopaxillus avec du liquide de culture du cresson et mesuré la croissance de celui-ci aprés 8 jours. Nous n'avons constaté aucune inhibition des plantules qui ont un bel aspect et des racines normalement

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Fig. 3 — Antagonisme exercé par le mycélium de Leucopaxillus giganteus sur la microflore du sol de prairie, Deux carrés de mycélium (en noir) ont ё г une boîte de milieu gélosé, ensemencée par 0,1 ml d'une dilution 10" de sol de prairie. Autour des carrés de mycélium, on distingue nettement une zone de 3-4 cm de diamètre dépourvue de colonies microbiennes.

développées. 11 n'y a donc pas de produits phytotoxiques dans ces extraits. Par contre, si on cultive le Leucopaxillus sur un milieu à base de peptone et que le liquide soit mélangé au milieu pour plantules, la croissance des racines de cresson est fortement inhibée (racines brunes, courtes ou inexistantes) et la hauteur des plantules réduite de moitié ; des produits Phytotoxiques sont alors presents dans le liquide de culture du Leucopaxillus. 11 у aurait plusieurs causes à la mortalité des phanérogames : 1) une asphyxie des plantes (comme- nous l'avons vu plus haut, le mycélium recouvre densément stolons et racines) ; 2) une

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56 P. KAISER [= profondeur (em) humidité (%) Lg 0-2 154 DES 252 7-10 23 T 0-2 24,5 7-10 18,8

Tableau 7 — Humidité (%) en fonction de la profondeur dans le sol à Leucopaxillus giganteus (Lg) et le sol témoin (T).

dessiccation de la terre envahie par le mycélium, d'oà un manque d'eau pour la plante. Nous avons fait une mesure d’humidite du sol, début juin (tableau 7). La surface de la terre envahie par le Leucopaxillus est desséchée par rapport à la terre témoin.

La dessiccation par la multiplication du mycélium a été rapportée par presque tous les auteurs. Edwards (1984) et Couderchet (1967) pensent que la mortalité des phanérogames vient en partie du manque d'eau. Des substances toxiques interviendraient aussi, comme le cyanure d'hydrogéne excrété par le Marasmius oreades (Lebeau & Hawn, 1963 ; Smith, 1980). Nous n'avons pas pu en mettre en évidence dans la terre envahie par le mycélium de notre champignon. Par contre, ce dernier en dégage lorsqu'il est cultivé au laboratoire sur des milieux peptonés. Le Leucopaxillus excréte la clitocybine qui exerce une action nécrosante sur les tissus (Rivière et al., 1947) ; or, les stolons et les racines des phanérogames sont recouverts directement par le mycélium du Leucopaxillus et, par conséquent, soumis à l'action nécrosante de la clitocybine. Reste l'ammoniaque, accumulé dans les anneaux. Maze (1925 in Molliard, 1925) indique que des teneurs de 10,5 mg d'azote ammoniacal / 100 mg de terre intoxiquent le mais. Nos résultats sont bien supérieurs à ces données. Au mois de juin, nous avons dose l'azote ammoniacal suivant la profondeur de l'échantillon (tableau 8). La teneur maximale en ammoniaque se situe dans la couche superficielle, là où se trouve la densité maximale de racines, de s mycélium. L'ammoniaque libéré par le Leucopax illus expliquerait donc, à lui seul, l'action léthale du Leucopaxillus sur les phanérogames ; c'est aussi l'avis de Couderchet (1967). En résumé, plusieurs causes peuvent déterminer la mort des phanérogames : l'asphyxie, la dessiccation, la clitocybine, l'ammoniaque.

Développement du Leucopaxillus giganteus en laboratoire

Développement sur milieu terre

Deux souches sont isolées : l'une à partir de spores, l'autre à partir d'un morceau de sporophore de Leucopaxillus. Les deux souches ont été cultivées sur gélose malt- peptone et entretenues sur ce milieu. A partir de cultures en boites, on preleve des morceaux de 1,5 cm de côté qui servent a inoculer les Erlenmeyers contenant de la terre ou des racines de plantes de la prairie. La terre subit trois traitements : stérilisation à l'autoclave, stérilisation et réinoculation avec une suspension-dilution de terre au 1/10, terre non traitée. La terre est incubée à 18° et à 4° С. Les morceaux de mycélium sont placés au centre de l'Erlenmeyer à la surface de la terre et les résultats de la croissance notés aprés 15 jours, 1, 2, 4 mois d'incubation. Le mycélium du Leucopaxillus se développe trés bien sur la terre stérile. On obtient un développement maximalen un mois, à 18° C. A 4° С,

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Profondeur (cm

Tableau 8— Quantité d'azote ammoniacal (mg/100g de terre) en fonction de la profondeur dans le sol à Leucopaxillus giganteus (Lg) et le sol témoin (T).

la croissance se révèle beaucoup plus lente et n'atteint pas encore le développement maximal aprés 4 mois d'incubation. Sur racines stériles, la croissance est plus abondante. Par contre, sur terre ou racines non stériles ou sur terre stérile réinoculée, elle s'avére nulle à 18° C et faible ou trés faible à 4° C (figures 4, 5). Des résultats similaires sont obtenus lorsque l'inoculum provient d'une culturesur terre à + 4? C. Nous avons fait varier les substrats et les conditions d'incubation en utilisant, par exemple, des blocs de pelouses incubés à l'air ou en sacs plastiques et à différentes températures mais les résultats étaient identiques. On peut donc conclure que le mycélium de Leucopaxillus subit, de la part de la microflore du sol, un fort antagonisme, lequel est atténué à basse température oü le Leucopaxillus trouve une moindre résistance. Cela se confirme par le fait qu'à 4? C, seule une faible proportion de moisissures, isolées du sol témoin, pousse correctement (4 souches sur 24) alors que le Leucopaxillus croit à cette température. Dans les tests d'antagonisme, il peut méme chevaucher le mycélium de quelques moisissures avant méme qu'elles puissent apparaitre.

Gramss (1981) a lui aussi décrit cet antagonisme du sol vis-à-vis des Basidiomy- cètes. Sur 17 terres étudiées, 15 inhibent complètement le développement des mycéliums et dans les 2 terres non inhibitrices, les Agaricus refusent de se multiplier. Les autres Basidiomycètes croissent grâce à la présence de plantes cultivées bien déterminées. Selon Gramss (1985), l'inhibition de la croissance des Basidiomycétes serait düe à des composés volatils provenant de la décomposition des végétaux supérieurs. Boyle (1995) a montré qu'il fallait éliminer les moisissures par du Bénomyl pour réussir l'introduction d'un Basidiomycéte. D'après Kackley et al. (1989), le Bénomyl n'influence pas le développe- ment des Basidiomycètes à rond de sorcière.

Développement sur milieux de culture semi-synthétiques et synthétiques

A partir du milieu de Zscheile (1951), nous avons composé un milieu simple (voir matériel et méthode) dans lequel nous avons estimé les meilleures sources d'azote et de carbone par pesée du mycélium (résultats non figurés).

Source d'azote : L'azote organique complexe (peptones) fournit la meilleure source d'azote. La bactopeptone (Difco) dont on ne connait pas le procédé de fabrication est la meilleure peptone. Sur peptone de caséine, le milieu a tendance à brunir. D'autres Sources d'azote peuvent servir comme le glutamate mais l'alanine, l'asparagine ou le chlorure d'ammonium constituent des sources d'azote médiocres.

Source de carbone : Le Leucopaxillus utilise une grande variété de glucides sur milieu peptone. Il croit sur : glucose, galactose, fructose, xylose, saccharose, maltose, lactose, cellobiose, mannitol, amidon pectine, CMC, inuline. La croissance, partiellement inhibée par le lactose, l'est fortement par l'arabinose bien que ces deux sucres soient utilisés. Le Leucopaxillus ne digére pas la cellulose, l’alcalilignine ni l'acide humique.

Source : MNHN. Paris

“48°C 18°C Terre stérile

Terre sterite | reensemencee

Fig. 4 — Croissance du mycélium de Leucopaxillus giganteus à 18° C sur la terre de prairie stérile (à gauche) et non stérile (à droite).

4°C

4°C &*‹ Terre stérite КО Terre sterite Hl Terre non sterite AR reensemencee we x

Fig. 5 — Croissance du mycélium de Leucopaxillus giganteus à 4° С

sur la terre de prairie stérile (à gauche) et non stérile (à droite),

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Mathur (1970) démontre que Marasmius oreades, en culture pure non agitée, assimile des fractions d'humus provenant de sources très différentes. La croissance est très stimulee (+ 50 %) par le bouillon de carottes ; Hollande (1945) avait déjà noté ce fait. En présence de glucides, les milieux sont acidifiés, excepté pour le saccharose, l'inuline, le mannitol, la CMC.

Leucopaxillus utilise le dextrane, un polyoside bactérien. Nous avons réussi le développement du Leucopaxillus à la surface de tapis bactériens incubés à basse tempé- rature. Les bactéries, isolées de la rhizosphére du sol témoin, avaient été cultivées sur un milieu pauvre en azote organique ou avec de l'azote ammoniacal. Or, 80 % des bactéries de la rhizosphére sont capsulées et synthétisent des polyosides (Webley et al., 1965). Par contre, le Leucopaxillus refuse de croitre sur tapis de moisissure.

Une bonne croissance s'effectue sur milieu malt-peptone liquide ou gélosé. Elle est inhibée par l'azoture de sodium (0,1 g/l-1) et le bicarbonate de sodium (2 g/l).

Discussions et conclusions

La multiplication du mycélium de Leucopaxillus giganteus dans le sol d'une prairie est limitée dans le temps : de la fin de l'hiver jusqu'au début du printemps. L'avancement du mycélium en forme d'anneaux s'effectue irréguliérement et la progres- sion est d'autant plus forte que la saison est froide et humide. Sa multiplication va entrainer un certain nombre de modifications : mort des phanérogames, élimination des moisissures, hausse du pH par production d'ammoniaque, stimulation de plusieurs enzy- mes et accélération de la minéralisation du carbone et de l'azote organiques. Ces pertur- bations, communes à d'autres Basidiomycétes se développant en cercle dans les prairies, ont été décrites par plusieurs auteurs (Couderchet, 1967 ; Edwards, 1984). Les cultures de Leucopaxillus sur terre au laboratoire révélent qu'en présence de la microflore naturelle du sol, le mycélium du Basidiomycéte a beaucoup de mal à s'imposer et ne peut croitre, de facon limitée, qu'à basse température. Ces observations in vivo et in vitro laissent penser que le Leucopaxillus profite d'un vide biologique pour dominer la microflore au repos. En effet, il se multiplie assez bien à basse température, ce qui n'est pas le cas de la majorité des moisissures et des bactéries de ce sol. En hiver, le Leucopaxillus supplanterait les moisis- sures avant méme que ces dernières ne se développent. Boyle (1995) a montré qu'il fallait éliminer les moisissures pour réussir l'introduction d'un Basidiomycete. Mais intervient aussi le facteur nutritionnel : l'observation in situ nous montre un mycélium collé à la surface des stolons et des racines qui doit tirer parti des exsudats radicellaires et des polysaccharides bactériens, faits corroborés par les expériences in vitro : sa respiration est fortement stimulée par des extraits radicellaires sucrés et il peut croitre à la surface de tapis bactériens. Pourrait-il s'imposer grâce à son antibiotique, la clitocybine ? Pas complète- ment, car celle-ci n'a de prise que sur les bactéries et les actinomycètes, non sur les moisissures. Pourtant, ce sont précisément ces derniéres qui sont éliminées lors de l'avan- cement, les bactéries et les actinomycétes souffrant moins de sa présence. Nous n'avons pas Observé de mycélium reliant l'ancien cercle au nouveau ; sans doute la progression s'effectue-t-elle grâce aux spores. En conclusion, on ne sait pas encore exactement com- ment le Basidiomycéte s'impose temporairement dans le sol de prairie mais on constate qu'il a besoin, pour ce faire, d'un vide biologique et d'un nutriment approprié.

Source : MNHN, Paris

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INFLUENCE DE LA MONENSINE SUR L’ULTRASTRUCTURE ET LA COMPOSITION BIOCHIMIQUE DES FRACTIONS PARIETALES DU BOTRYTIS CINEREA.

YAHYA КОША, ABBES ES-SGAOURI! et ROBERT DARGENT?(*)

‘Laboratoire de Biologie et Physiologie Végétales, Faculté des Sciences I — Ain Chock, Université Hassan II, Km 8, Route El Jadida, B.P. 5366 Maarif, Casablanca, Maroc. ?Laboratoire de Mycologie Végétale, Université Paul Sabatier, 118, Route de Narbonne, 31062 Toulouse CEDEX, France

(*). Auteur à qui faire parvenir toute correspondance.

RÉSUMÉ : Les effets de la monensine sur la morphogenése et la composition chimique des différentes fractions pariétales du Botrytis cinerea ont été étudiées. Cet ionophore inhibe la croissance, modifie l'ultrastructure et induit des variations dans la proportion des différents monomeres qui se traduisent par la diminution des oses neutres et des acides aminés et l'augmentation du phosphore inorganique et des oses aminés (chitine) en particulièr dans la fraction 4. Ces modifications montrent que la monensine affecte le trafic vésiculaire ainsi que les enzymes responsables de la synthèse pariétale et donc d'une croissance normale.

MOTS CLEFS : Borrytis cinerea ; Monensine ; Ultrastructure ; Fractions pariétales.

SUMMARY : The effects of monensin on morphogenesis and chemical composition of wall frac- tions of Botrytis cinerea were studied. The ionophore inhibits the fungal growth, modifies the ultrastructure and induces modifications of various monomers. We observed the decrease of neutral sugars, amino acids and uronic acids, and an increase of inorganic phosphorus and amino sugars (chitin) specially in fraction F4. These results show that monensin affects the vesicular traffic and enzymes responsible for normal wall synthesis and therefore normal growth.

KEY WORDS : Botrytis cinerea ; Monensin ; Ultrastructural ; Wall fractions.

INTRODUCTION

Les champignons filamenteux ont un mode de croissance apicale caractérisé par une distribution polarisée des différents systemes endomembranaires (Wessels, 1986).

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L'insertion de façon continue de nouveaux matériaux dans la paroi cellulaire au niveau de l'apex, assure la croissance de l'hyphe fongique (Prosser & Trinci, 1979 ; Gooday & Trinci, 1980). De plus, les précurseurs pariétaux, les enzymes et leurs substances régulatrices sont transportés à l'apex dans des vésicules golgiennes, suivant des processus sécrétoires trés organisés (Cabib ег al., 1979 ; Gooday, 1983). La monensine, ionophore carboxylique qui se lie aux ions Na*, K* et à des protons (Pressman & Fahim, 1982) provoque la vacuoli- sation de l'appareil de Golgi et modifie ainsi les processus sécrétoires aussi bien chez les cellules animales que végétales (Mollenhauer et al., 1990 ; Calzoni et al., 1993 ; Ciampo- lini et al., 1993 : Kimura et al., 1993 ; Hoffmann-Benning et al., 1994 ; Bou-Gharios et al., 1994).

Des travaux ont montré que les champignons sont sensibles à la monensine (Liu, 1982). L'ionophore a une influence sur la morphogenése fongique (Poli et al., 1986 ; Sewall et al., 1986 ; Pancaldi er al., 1994). П inhibe la croissance et la biosynthese des lipides (Weete et al., 1989 ; Fonvieille et al., 1991) ainsi que la sécrétion des cutinases chez Fusarium solani (Podila et al. 1995). Dans un précédent travail (Koulali er al., 1992, 1996a,b), nous avons montré que la monensine modifie la composition globale des parois, du plasmalemme ainsi que la sécrétion et la structure des exopolysaccharides de champi- gnons appartenant à différents groupes taxonomiques. Dans le présent travail nous décrirons les effets de la monensine sur la croissance, l'ultrastructure et la composition des différentes fractions pariétales du Botrytis cinerea.

MATERIEL ET METHODES

Matériel biologique

Botrytis cinerea Pers. provient du Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn (Pays-Bas).

"Techniques générales

Le milieu expérimental de culture a été décrit antérieurement par Thomas (1972). Ce milieu liquide a été mis dans des fioles de Roux à section trapézoidale à raison de 100 ml par fiole puis sterilise à l'autoclave à 110° C pendant 20 min. Les ensemence- ments ont été faits à partir d'une suspension mycélienne issue de précultures âgées de 6 jours, broyées stérilement à l’ultra turax pendant 30 secondes.

Préparation de la monensine A partir d'une solution mère de monensine dissoute dans l'éthanol à 90° (50 ug/ ul), nous avons effectué des dilutions de telle manière à obtenir la concentration de

10 pg/ml. La monensine est ajoutée aseptiquement au milieu de culture avant l'ensemen- cement.

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MONENSINE ET PAROIS DU BOTRYTIS CINEREA 65

Conditions de développement

Les cultures en condition statique sont mises à incuber à 24° C et à l'obscurité.

Mesure de la croissance

La détermination de ce paramètre est réalisée par la technique des masses sèches. A intervalles réguliers, le mycélium est desséché à 80° C jusqu’à masse constante (24 h). Les résultats représentent la moyenne des masses obtenues à partir de cinq erlenmeyers de culture récupérées tous les 2 jours.

Techniques microscopiques

Afin d’avoir des hyphes facilement orientables et dans le but d'obtenir des coupes ultrafines passant au niveau des zones apicales, nous avons repris une technique décrite par Dargent (1977). L'inoculum de B. cinerea est déposé sur un film de cellophane recouvrant un milieu nutritif gélosé (avec et sans monensine). Quand la culture, dont l’äge n'excéde jamais 48 heures, a atteint le développement souhaité, nous découpons délicatement le film de cellophane en suivant rigoureusement les bords de la colonie. Ensuite, nous plongeons très rapidement l'ensemble cellophane, filaments mycéliens dans une solution de glutaral- déhyde à 3 % dans un tampon cacodylate 0,1 M, pH 7,2 évitant ainsi les risques d'artéfacts au niveau des zones apicales des filaments. Aprés post-fixation dans le tétroxyde d'osmium, les échantillons sont deshydratés dans l'alcool. A la fin de la déshydratation, nous découpons de petits carrés d’1 mm2 environ, en ayant soin de ne prendre que la zone terminale des hyphes. Ces carrés, aprés imprégnation dans l'Epon 812 ou le Spurr sont déposés à plat dans une goutte de résine fraiche, à la surface d'une gélule tronquée. Aprés polymérisation, des coupes longitudinales passant dans les zones apicales des filaments sont obtenues sur ultramicrotome Reichert OMU3. Comprises entre 400 et 800 À elles sont recueillies soit sur des grilles en cuivre de 200 mesh et soumises à la double coloration acétate d'uranyle-citrate de plomb, soit sur des grilles en or et soumises à la coloration de Thiery (1967) pour la mise en évidence des groupements vic-glycol.

Les fractions pariétales sont mises en suspension aqueuse par passage rapide aux ultrasons et une goutte est disposée sur une grille en cuivre de 200 mesh. Un ombrage Re au platine est effectué sous un angle d’environ 10 degrés sous un évaporateur rotatif

iber.

Toutes les observations sont faites avec un microscope Philips EM 301 travaillant sous une tension de 80 KV.

Préparation du complexe WGA-or colloidal et marquage cytochimique

L'or colloïdal (Au17) a été préparé selon la méthode de Geoghegan & Ackerman (1977). La WGA (IBF) a été conjuguée à la suspension d'or colloidal suivant la technique décrite par Roberts er al. (1983). Pour le marquage cytochimique, les coupes sont montées sur grilles en or ou nickel. Ces grilles sont d'abord déposées sur une goutte de tampon phosphate (P.B.S.) 0,05 M, pH 7,0, puis mises sur le complexe WGA-or colloidal durant des temps variables de 20 minutes à 2 heures. Aprés incubation, les coupes soigneusement

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66 Y. KOULALI et al.

lavées dans du tampon P.B.S. et dans de l'eau distillée sont soumises à la double coloration acétate d'uranyle-citrate de plomb. Pour démontrer la spécificité du marquage, plusieurs témoins sont réalisés :

— incubation des coupes avec le complexe WGA-or colloidal préalablement neutralisé avec le N-N'-N" triacétylchitotriose (2mM).

— incubation des coupes avec le complexe albumine-or à la place du complexe lectine-or.

— incubation des coupes avec l'or colloidal seul.

Isolement, purification et fractionnement des parois

L'isolement et la purification des parois ont été décrits antérieurement (Koulali et al., 1992). Le fractionnement est réalisé selon la méthode de Mahadevan & Tatum (1965) par traitement successifs aux alcalis et aux acides résumés dans la Fig. 1.

Techniques biochimiques

L'hydrolyse des fractions pariétales en vue de l'analyse des oses neutres a été réalisée à l'aide d’H,SO, 22 N pendant 5 min à 50° C et d'H,SO, 2 N pendant 15 há 100° C (Harris & Taber, 1973). Les oses neutres totaux ont été dosés par la méthode à l'anthrone (Mokrash, 1954), par celle au phénol sulfurique (Hodge & Hofreiter, 1962), ou par celle des oses réducteurs selon Somogyi (1952). Le dosage des acides uroniques a été effectué à partir du méme hydrolysat selon la méthode de Blumenkrantz & Asboe-Hansen (1973).

En vue de l'analyse des oses aminés, les fractions pariétales ont été hydrolysées à l'HCI 6 N pendant 6 hä 100° C. Les hydrolysats ont été récupérés par filtration, évaporés à sec et repris plusieurs fois par l'eau distillée jusqu'à élimination complete de l'acide. Le dosage des oses aminés a été effectué en utilisant la méthode d'Elson-Morgan modifiée (Tracey, 1955). Le dosage des acides aminés totaux provenant d'une hydrolyse à l'HCI 6 N pendant 15 h à l'étuve, à 100° C, a été réalisé selon la méthode de Spies (1957).

RESULTATS

Dans des expériences préliminaires, nous avons déterminé la tolérance de plu- sieurs espéces de champignons vis-à-vis de la monensine et constaté que le B. cinerea était l'une des espéces les plus sensibles à cet effecteur. La concentration de 10 ug/ml de monensine, seulement fongistatique, représente la concentration minimale qui donne le maximum d'effets (Koulali, 1992).

Evaluation de la croissance :

Nous avons étudié la croissance du B. cinerea sur milieu synthétique dans lequel nous avons ajouté de la monensine à la concentration de 10 ug/ml. Durant cette expé-

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MONENSINE ET PAROIS DU BOTRYTIS CINEREA 67

200 mg de Parois lyophilisées.

NaOH 2N Température ambiante. Durée : 16 heures

Centrifugation

Culot Sürnageant H2SO4 IN Addition de SOA(NH4)2

ретше 90°С saturé à 60% ou 2 volumes. urée : 16 heures D'éthanol 95°

Précipité centrifugé,

Centrifugation. remis en suspension dans H20, dialyse et Iyophilise = Fraction 1

Surnageant Culot Hydroxyde de barium 2 lavages avec NaOH 2N pH = Température ambiante

Durée : 30 minutes

Précipité centrifugé Centrifugation.

Culot Suinageant

z Addition de 2 volumes Surnageant = d'ethanol 95° Fraction 2

Remis en suspension dans

ité centrifugé,

H20, dialysé et lyophilisé = remis en suspension dans Fraction 4 H20, dialysé et lyophilisé = Fraction 3

Fig. 1 : Fractionnement des parois selon Mahadevan & Tatum (1965)

rience, nous avons pris soin de réaliser deux contrôles : le milieu synthétique avec le solvant (10 ul d'éthanol) et le milieu synthétique seul. Toutefois, comme la présence du solvant wentraine aucune modification de la croissance et qu'il y a une grande similarité entre les masses sèches obtenues en fonction du temps, nous ne donnerons qu’une courbe témoin. La figure 2 résume les résultats obtenus. Nous constatons que la courbe témoin est Caractéristique des courbes de croissance fongique : (i) une phase de latence n'excédant jamais plus de 48h; (ii) une croissance exponentielle caractérisée par un important accroissement de la masse, le maximum de croissance étant atteint au 12° jour de culture ; (iii) enfin un état stationnaire, caractérisé par une masse de matière sèche stable.

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500 400 ] E | 2 © = æ 300] JF ч = o © J а 200 —— Témoin E 4 ——e— 10yg/ml de monensine 2 100

0 2 4 6 8 COIN ъё 18

jours

Fig. 2 : Effet de la monensine sur la croissance du B. cinerea

Fig. 3. — Organisation cytologique des zones apicales en croissance du Botrytis cinerea. a-b-d-e : glutaraldéhyde-tétroxyde d’osmium ; acétate d’uranyle-citrate de plomb ; с: glutaraldéhyde-tétroxyde d’osmium ; acide périodique-thiocarbo-hydraside-protéinate d'argent.

a — Coupe longitudinale passant dans la zone nucléaire d'une hyphe témoin. La Paroi (P) est transparente aux électrons et le plasmalemme est rectiligne (PI). Le cytoplasme renferme des noyaux (N), des mitochondries (M) et du réticulum endoplasmique (RE). Dans cette zone apparaissent les premières vacuoles (Va). Echelle : 1 u.

b— Coupe transversale passant dans la zone apicale en croissance d'une hyphe témoin. La Paroi (Р) est limité extérieurement par un réseau fibrillaire d'exopolysaccharides plus ou moins dense aux électrons (flèche). Echelle : 0,1 u.

c— Coupe longitudinale passant dans la zone apicale en croissance d'une hyphe témoin. La détection des polysaccharides par le test de Thiery montre une réaction intense au niveau de la paroi (P) et du plasmalemme (Pl). Echelle : 0,5 p.

d-e — Coupes transversales passant dans les zones apicales en croissance d'une hyphe se développant en présence de monensine à la concentration de 10 ug/ml. La paroi (P), limitée extérieurement par des exopolysaccharides (flèche), est plus épaisse et apparait constituée de deux couches. Le plasmalemme (PI) est fortement festonné et les mitochondries (M) ont une matrice dense aux électrons. On note l'apparition trés rapide de grandes vacuoles (Va). Des lomasomes (Lo) et des structures lytiques (double flèches), séquestrant des territoires cytoplasmiques, peuvent s’observer. Echelle : 0,5 н.

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MONENSINE ET PAROIS DU BOTRYTIS CINEREA 69

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À. bisexualis | В. cinerea | S. rolfsii il témoin Monensine |

[fractions Monensine | témoin | Monensine | témoin

F1 22,64 17,57 20,21 14,46 31,48 25,96 F2 22,81 35,90 37,64 34,66 32,02 42,84 F3 26,54 20,20 21,23 20,68 12,62 8,58 F4 28,01 26,33 21,27 30,20 23,88 22,61

Tableau 1 : Pourcentage des fractions pariétales en présence et en absence de monensine

La présence de monensine diminue fortement le développement mycélien. Les pourcentages d’inhibition sont compris entre 93 % (12° jour : maximum de croissance) et 100 %.

Morphologie ultrastructurale

Les coupes ont été réalisées dans les parties apicales des hyphes. Sur milieu témoin, le diamètre des hyphes varie entre 2,5 et 3 y et l'épaisseur de la paroi n'excède pas 800 A° (Fig. 3,a). La paroi apparaît amorphe, dépourvue de stratification apparente, faiblement contrastée aux électrons après la double coloration acétate d'uranyle-citrate de plomb. Elle possède extérieurement un fin réseau fibrillaire d’exopolysaccharides plus dense aux électrons (Fig. 3,b). La réaction de Thiery donne un résultat positif et uniforme pour l'ensemble. Le plasmalemme est régulier et le cytoplasme renferme les différents systémes endomembranaires (Fig. 3,c).

En présence de monensine (Fig. 3,d-e), le diamétre des hyphes est legerement plus large (de 3,5 à 5,5 u) et la paroi est plus épaisse (2 000 A°). Elle apparait constituée de deux couches : la couche interne étant plus contrastée que la couche externe. Un réseau fibrillaire d'exopolysaccharides limite extérieurement la paroi. Le plasmalemme apparait festonné et le cytoplasme vacuolisé renferme les différents systemes membranaires : les mitochondries étant dans ces conditions culturales plus petites et à matrice plus dense aux électrons aprés coloration acétate d’uranyle-citrate de plomb.

Sur les coupes traitées par le complexe WGA-or colloidal, nous constatons, sur micrographies d'hyphes cultivées en absence ou en présence de monensine, un marquage régulier, homogène au niveau de la paroi, plus dense en présence de l'ionophore. Aucun marquage n'est observé de facon significative au niveau du cytoplasme (Fig. 4,a-b-c). Enfin la spécificité du marquage est confirmée par les témoins : aprés inhibition avec le М-ММ triacétylchitotriose aucun marquage n'étant noté (Fig. 4,0).

Composition chimique des fractions pariétales :

Le fractionnement est réalisé par traitement successifs aux alcalis et aux acides selon Mahadevan & Tatum (1965) et la composition de chaque fraction est déterminée aprés hydrolyse.

Quatre fractions sont obtenues à partir des parois purifiées (tableau 1) :

— une fraction Fl extraite par NaOH 2N, précipitée par l'éthanol. Aprés dialyse et lyophilisation, elle représente 20,21 % des parois témoins. En présence de monensine le

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MONENSINE ET PAROIS DU BOTRYTIS CINEREA 71

pourcentage de cette fraction, par rapport au poids total des parois lyophilisées, subit une diminution importante de 28,45 %.

— une fraction F2 acido-soluble, neutralisée et lyophilisée, qui représente 37,64 % des parois témoins et qui subit une diminution d'environ 8 % en présence de l'ionophore.

— une seconde extraction alcaline du résidu conduit à la fraction F3 ; la précipitation par l'éthanol de cet extrait aboutit à l'obtention d'une quantité de matériel représentant après dialyse et lyophilisation 21,23 % des parois normales. La présence de monensine ne modifie pas le pourcentage de cette fraction.

— une fraction F4 résistante aux traitements par les alcalis et les acides repré- sente aprés dialyse et lyophilisation 21,27 % des parois témoins : la présence de la monensine entraînant une augmentation de cette fraction de 42 %.

La composition de ces différentes fractions a été analysée et les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau 2.

En se basant sur les résultats exprimés en pourcentage du poids de la fraction lyophilisée (%*), des parois non traitées par la monensine, la fraction F1 renferme essentiellement des oses neutres (38 %) et du phosphore (11 %) ; les fractions F2 et F3 des oses neutres (respectivement 9 % et 54%); enfin dans la fraction F4 on trouve du phosphore (33 %), de la glucosamine (environ 20 %) et des acides aminés (environ 20 %). La présence de monensine n'entraine pas de grandes variations.

[ Fat Freien? ТТЫ Freien Tar Constituants témoin _ | Monensinc émoin _] Monensine moin _ | Monensine sémoin_ | Monensine 3émeim — | Monensine fous 33 — — $5 — 50 — E mee 7 ser | 7% ВЯ 3a o а гыш AAA Wem x | 2 110 02—087 Tae 100 [100 — 35 ds ЕСО EC EN Ut on | i5 so | зз вв D] 210 m 510 15 + 38 I ma її | Mer oe он im ил uw os | is o | ew m Rem | 27 T ise I m 10 an ipa ce ЕЕЕ PS à оз Oe | à um [Phosphore 10.94 D 165 153 476 164 3329 2060 i 2n in iR оз iol s | $m жы | um ng

NOTA ls este sont exprimés en pourcentage du poids de la fraction ораде (4) ou en pourcentage du poids des parois yophilisécs (2) Тош = pourcentage du constituant dans les parois totales

Tableau 2 : Variations de la compositions des différentes fractions extraites des parois de B. cinerea

Par contre les résultats exprimés en pourcentage du poids des parois lyophilisées (%**), montrent que, dans les parois témoins, les oses neutres se rencontrent au niveau des fractions F1 et F3 (respectivement 7,8 et 11,4 %), les oses aminés (4 %), les acides aminés (20 %) et le phosphore (33%) dans la fraction F4. En présence de monensine, les proportions des différents monomères restent plus ou moins identiques dans les fractions El, F2 et F3, alors que dans la fraction F4, on note, mis à part les acides aminés, une augmentation des différents constituants.

La précipitation éthanolique des fractions F1 et F3 extraites par la soude, laisse Supposer qu'il s'agit de polysaccharides liés à des protéines. La fraction F4 est la partie chitine de la paroi : en effet on sait que le polymére de la n-acétylglucosamine se caractérise par son insolubilité dans les acides et les bases dilués. Enfin, concernant le phosphore présent en abondance dans les parois du B. cinerea, ‘| subit une augmentation en présence de momensine.

Enfin, en méme temps que nous avons vérifié la pureté des fractions, nous avons comparé leur aspect ultrastructural aprés ombrage rotatif au platine. Les micrographies choisies comme illustration représentent les parois totales ainsi que la fraction 4 (Fig. 4e-f). N'ayant pas constaté de différences significatives entre les différentes fractions

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Fig. 4 a-d — Détection de la chitine par le marquage cytochimique WGA-or colloidal glutaraldéhyde-tétroxyde d'osmium ; WGA-Aul7 ; acétate d’uranyle-citrate de plomb ; e-f — Aspect morphologique des parois : ombrage rotatif au platine.

a — Parois (P) d'une hyphe non traitée par la monensine. Aucun marquage n'est observé de façon significative au niveau du cytoplasme : les grains étant localisés au niveau de la paroi. Echelle : 0,5 p. b-c — Parois (P) d'une hyphe traitée par la monensine. Nous notons une augmentation du marquage par rapport aux parois non traitées par l'ionophore. A comparer avec la Fig, 4,a. Echelle : b = 0,5 н; c=0,25 pi

€ — Paroi (P) d'une hyphe non traité par la monensine, aprés inhibition avec le N-N’-N” triacétyl- chitotriose, Aucun marquage n'est noté de facon significative, confirmant ainsi la spécificité du marquage. Echelle : 0,5 p.

f — Aspect de parois totales obtenues à partir d’une culture témoin âgée de 5 jours. Echelle : 0,5 p. е — Aspect fibrillaire de la fraction F4 de parois obtenues à partir d'une culture se développant sur milieu témoin. Echelle : 0,5 н.

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MONENSINE ET PAROIS DU BOTRYTIS CINEREA HS

pariétales témoin et expérience, nous ne donnerons pour illustration que les parois témoins. Les parois totales présentent un fond homogene granuleux dans lequel nous distinguons plus ou moins nettement des fibrilles enchevétrées (Fig. 4,e) alors que la fraction F4 se caractérise par une texture fibrillaire plus nette correspondant aux fibres de chitine (Fig. 4,f).

Pour les temps d'exposition étudiés, la monensine à la concentration de 10 ug/ml n'a jamais eu un effet létal sur le B. cinerea : champignon filamenteux se caractérisant par un appareil de Golgi atypique. Elle inhibe sa croissance plus intensément en condition statique qu'en agitée : le pourcentage d’inhibition compris entre 93 et 100 % en culture Statique, ne dépassant pas les 80 % en culture agitée (Koulali er al., 1996a). Ce résultat est en accord avec des travaux antérieurs obtenus chez d’autres champignons appar- tenant à des groupes taxonomiques différents : cette diminution de la croissance pou- vant résulter d'une inhibition de la synthèse des stérols (Weete et al., 1989). En outre, Pancaldi er al. (1994) constatent que la monensine provoque l'inhibition de la croissance chez la forme levure du Candida albicans. Dans des travaux précédents, nous avons mon- tré que, chez I’ Achlya bisexualis, le site d'action de la monensine est l'appareil de Golgi et que sa présence dans le milieu de culture a un impact négatif sur la composition et le fonctionnement des différents systémes endomembranaires impliqués dans les processus sécrétoires, et donc dans les mécanismes de croissance (Koulali, 1992 ; Кошай er al., 1996b).

L'examen comparatif en microscopie électronique de coupes en présence ou en absence de monensine fait apparaitre des différences tant au niveau du complexe plasmalemme-paroi que des cytomembranes. En présence de monensine les parois appa- raissent plus épaisses et le plasmalemme est fortement festonné, des structures lomasomi- ques lui étant associées. Concernant les systémes endomembranaires, les variations S'observent au niveau de l'appareil vacuolaire plus important et des mitochondries plus petites et à matrice dense aux électrons. Ces observations ultrastructurales que nous avons réalisées sur l'influence de la monensine sur des zones apicales en croissance n'avaient à notre connaissance, jamais été entreprises sur des champignons filamenteux. Cependant, ces résultats peuvent être reliés à ceux obtenus par Poli et al. (1986) sur des blastospores de Candida albicans qui montrent que la monensine affecte la synthèse de la chitine et ainsi augmente l'épaisseur de la paroi. De leur cóté, Sewall er al. (1986) ont constaté une vacuolisation importante lors de la formation des zoogametes et des zoospores chez Allomyces macrogynus. De plus chez I’ Achlya bisexualis nous avons montré que la monen- sine provoque des modifications au niveau des saccules golgiens qui gonflent puis se disloquent : les dictyosomes perdant leur aspect morphologique classique (Koulali, 1992). Enfin, en ce qui concerne les mitochondries nos résultats sont en accord avec ceux obtenus par Mollenhauer et al. (1981, 1983, 1990), sur des cellules animales, puis Cunninghame & Hall (1986), Rudolph & Schnepf (1988) et Ciampolini et al. (1993), sur des cellules végétales, qui notent une altération des mitochondries accompagée d'une matrice dense aux électrons.

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Les parois du B. cinerea témoins (c’est à dire en absence de monensine) cons tuées en majorité par des oses neutres (25 %), se caractérisent aussi par la présence d’oses aminés (5 %), d'acides aminés (environ 7 %), de phosphore en quantité relativement élevée (environ 10 %) et d'acides uroniques en quantité peu importante ne dépassent pas les 2,5%. Elles sont classées dans le groupe chitine-glucane (Bartnicki-Garcia, 1968). La présence de l'ionophore dans le milieu de culture n'entraine que des variations quantita- tives dans la proportion des différents monomères se traduisant par une importante diminution du rapport (oses neutres acides uroniques)/oses aminés. Nous notons également une diminution des taux des acides aminés et une augmentation du phosphore inorganique.

Nos résultats concernant le fractionnement des parois témoins se rapprochent de ceux trouvés par d'autres auteurs. Chez les espéces de type chitine-glucane, la fraction F4, résistante aux traitements par les alcalis et les acides, représente toujours la partie chitine de la paroi. Ceci a été montré chez Neurospora crassa (Mahadevan & Tatum, 1965), Aspergillus niger (Johnston, 1965), Mucor mucedo (El Mougith et al., 1988) et Aspergillus fumigatus (Hearn & Sietsma, 1994 ; Ghfir, 1995). Ces mêmes auteurs ont constaté que les autres fractions (non résistantes aux différents traitements), sont constituées en grande partie par des glucanes.

La présence de la monensine dans les milieux de culture se traduit par des variations au niveau de la composition chimique des différentes fractions pariétales. Dans la fraction 4, nous notons une augmentation des oses aminés (donc de chitine), confirmant nos résultats sur les parois totales (Koulali er al., 1992). Cette augmentation qui a été aussi constatée par Poli er al. (1986), Pancaldi et al. (1994) chez Candida albicans, serait le résultat d'une perturbation de l'enzyme intervenant dans sa synthése, la chitine synthé- tase : la monensine transforme la forme inactive de l'enzyme en forme active et en agissant sur le trafic vésiculaire, provoque un déséquilibre avec prédominance des facteurs activa- teurs sur les facteurs inhibiteurs. Il est possible que les modifications importantes du taux de Na+ et de K+ dans les cellules, conduit à l’activation des proenzymes par des mécanismes différents de ceux intervenant dans le trafic vésiculaire normal (Poli et al., 1986).

La monensine provoque la diminution des oses neutres au niveau des fractions Fl et F3 (fractions riches en glucanes chez le témoin). Ce résultat corrobore les obser- vations précedemment obtenus sur la composition globale des parois fongiques (Kou- lali et al., 1992) et peut étre mis en relation avec les travaux de Rudolph & Schnepf (1988) qui ont montré que chez Funaria hygrometrica le nombre de rosettes impliquées dans la synthése de la cellulose diminue trés rapidement en présence de monensine. Moore et al. (1991), ont constaté que la monensine inhibe le transport de l'hémicellulose neutre vers la paroi. De leur cóté, Zhang er al. (1993) dans une culture de sycomore constatent que la monensine inhibe la synthése de la cellulose. Plus récemment, Satia-Jeunemaitre et al. (1994) ont montré que la biosynthése et/ou la transformation des polysaccha- rides dans une culture cellulaire de sycomore sont affectés par l'ionophore. Enfin, Goubet et al. (1994) ont rapporté que chez le lin, la monensine induit une augmentation de l'activité de la glucane synthase II, par contre elle provoque la diminution de la glucane synthase I et de la galactane synthase, enzymes impliqués dans la synthése de la paroi cellulaire.

La présence de monensine dans le milieu de culture provoque une diminution des acides aminés (donc de protéines) dans les différentes fractions pariétales, confirmant ainsi les résultats antérieurs obtenus aussi bien chez les champignons (Podila er a/., 1995) que chez les végétaux supérieurs. Melroy & Jones (1986) chez Hordeum vulgare et Sticher &

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MONENSINE ET PAROIS DU BOTRYTIS CINEREA 75

Jones (1988) chez Zea mais constatent une inhibition de la sécrétion de l'amylase en présence de la monensine.

Enfin, la monensine accroit fortement la quantité de phosphore dans la fraction 4, Nous n'avons pas recherché sous quelle forme le phosphore était présent dans ces parois, ni la nature des liaisons éventuelles avec les autres polymères. Datema et al. (1977) pensent qu'il s'agit de polyphosphates de poids moléculaire élevé. L'accroissement de leur propor- tion doit modifier la structure de cette fraction pariétale.

En conclusion, nous avons montré que la monensine a un effet inhibiteur sur la croissance fongique. Elle provoque des variations dans la composition chimiques des fractions pariétales fongiques. L'ensemble de ces modifications doit étre mis en relation avec les changements qui se manifestent au niveau des dictyosomes et des phénomènes sécrétoires, comme cela a été observé chez d'autres espèces végétales (Shannon & Steer 1984 ; Rudolph & Schnepf 1988 ; Moore et al., 1991) et chez des champignons à appareil de Golgi typique (Koulali, 1992). Une étude cinétique sur les variations provoquées par la monensine sur les dictyosomes est actuellement en cours.

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POPULATIONS OF FUNGI IN SOME RESERVOIRS IN SERBIA

Branislav RANKOVIC Faculty of Science, University of Kragujevac, Yugoslavia

ABSTRACT : The paper presents results of mycological studies conducted in the three larger reservoirs in Serbia (Celije, Grosnica and Gruza), which have different hydrological and production characteristics, These studies were conducted during all seasons of 1996. The quantitative analysis of fungal communities showed that the average number of their spores in these reservoirs was between 2000 and 4990 per liter of water. The highest number of spores was found in eutrophic reservoir of Gruža and the lowest identified in oligo-mesotrophic reservoir of Ćelije. Number of spores was higher in the water samples taken near the bottom of the lakes and in littoral zone rich with macrovegetation, than in the middle water layers. In these reservoirs 45. species were identified out of. 384 isolates, The most dominant genera were Aspergillus, Penicillium, Cladosporium, Fusarium, Phoma, Rhizopus and Verticillium. The autochthonous aquatic fungal community was composed of the following species: Achlya americana, Achlya racemosa, Catenaria sp., Dictyuchus sterile, Pythium ultimum, Saprolegnia ferax, Saprolegnia hypogyna and Saprolegnia monica.

KEY WORDS : allochthonous and autochthonous aquatic fungi, reservoir.

RESUME : Le présent article résume les études mycologiques réalisées sur les trois plus impportants réservoirs de Serbie (Celije, Groënica et Gruza), qui possèdent des caractéristiques hydrologiques différentes. Ces études ont été effectuées durant l'année 1996. Les analyses quantitatives des commu- nautés fongiques indiquent que le nombre moyen de spores par litre d'eau est compris entre 2000 et 4990 ; la valeur la plus élevée correspondant au réservoir eutrophique de GruZa et la plus basse au reservoir oligo-mésotrophique de Ćelije. Le nombre de spores est plus important dans les échantillons prélevés à proximité du fond du lac et dans la frange littorale riche en macrovégétation, que dans les prélévements effectués en moyenne profondeur. Dans ces réservoirs 45 espéces ont été identifiées sur un total de 384 isolats. Les genres dominants sont : Aspergillus, Penicillium, Cladosporium, Fusarium, Phoma, Rhizopus et Verticillium. La communauté fongique aquatique autochtone était constituée des espèces suivantes : Achlya americana, Achlya racemosa, Catenaria sp., Dictyuchus sterile, Pythium ultimum, Saprolegnia ferax, Saprolegnia hypogyna et Saprolegnia monica.

MOTS CLÉS : champignons aquatiques allochtones et autochtones, réservoirs.

INTRODUCTION

Aquatic fungi play important role in the transformation processes of organic matter (Park, 1972a) in biohydrocenoses. They affect the numbers of other hydrobionates (algae, protozoans, insects etc.) causing their epiphytocia and accumulation of dead

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80 B. RANKOVIC

organic matter in ecosystem (Sen, 1988a, 1988b). They participate in destruction of autochthonous and allochthonous organic matter, providing food for some invertebrates and fish (Bärlocher, 1980, 1981) and also cause the water self-cleaning processes (Hynes er al., 1974). The fungi have not been extensively studied in the aquatic ecosystems of Serbia (Rankovié ег al., 1994; Vukojevié & Franié-Mihajlovié, 1994; Comié et al., 1995). The important role played by the aquatic fungi as structural and functional components of biohydrocenoses, as well as the fact that their research in Serbia is just beginning, have motivated us to conduct these studies. ,

The studies were conducted іп the three larger reservoirs in Serbia (Celije, Grosnica and Gruza), which have different hydrological and production characteristics. These reservoirs belong to different classification types (Selesi, 1989; Martinović- Vitanovié & Kalafatié, 1990; Rankovic er al., 1994). Accordingly, reservoir Celije belongs to oligotrophic-mesotrophic type, reservoir Grosnica belongs to mesotrophic type and reservoir Gruža belongs to eutrophic type. The qualitative and quantitative composition of the allochthonous and autochthonous fungal communities, distribution of isolates obtained and seasonal dynamics were monitored in the period of study.

MATERIALS AND METHODS

During 1996, water samples were collected from the reservoirs during all seasons of the year (March-M, June-J, August-A, October-O) on 4-5 sites in the central parts of the reservoirs. The samples were taken from the layer near the bottom of the reservoirs (L1), middle layer (L2) in the central parts of the reservoirs and from the area near the shore which was full of plants at 20-30 cm depth (L3). Water samples were collected with a 2 liter Ruttner sampler. Water samples were processed during the same day of their collection using the dilution plate technique, adding 2 ml of water on Malt-agar culture medium in Petri dish with three repetitions. The quantity of fungal spores was determi- ned by the number of the grown colonies. These were then isolated in pure cultures using standard mycological methods and replating on the selective culture media. AII cultures were incubated at 25C (+ 2) under day-night light exposure. Stock cultures are kept in the culture collection of the Faculty of Science, University of Kragujevac.

The autochthonous, aquatic fungi were studied by direct microscopic examina- tion of the water and material collected by a baiting method with seeds of Canabis sativa, cellophane and nail pieces (Arnold, 1968). The isolated species were identified using following literature: Middleton (1943), Raper & Thom (1949), Cooke (1963), Raper & Fennel (1965), Coker (1969), Seymour (1969), Gilman (1971), Barnet & Hunter (1972), Batko (1975) etc.

CHARACTERISTICS OF RESERVOIRS

Celije reservoir is located on the river Rasina, 30 km away from the city of Kruševac. Constructed in 1979, it has a drainage basin of 598 km2 and the reservoir itself has a surface of 60 km2, a volume of around 60 х 10° m* and maximum depth of 40 m The current purpose of Celije reservoir is to supply only the city of Kruševac with drinking

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POPULATIONS OF FUNGI IN SOME RESERVOIRS IN SERBIA 81

water, however it will soon be used for the same purpose serving the neighbouring cities: Paracin, Cuprija and Jagodina. Based on the level of primary organic production and analysis of plankton species as indicators of trophic conditions, it can be concluded that the lake belongs to the mesotrophic type (Selesi, 1989; Ranković er al., 1992).

Grosnica lake was made in 1931 by building a dam on the Groënica river, right affluent of Lepenica river. It is located in the vicinity of Kragujevac and is used for supplying this city with water. Initial volume of the lake was 1.7 х 10%m?, The dam height was increased by 7 m in 1962, thus increasing the lake volume to 3.1 x 105 m?. The total dam lenght is 138 m, and its height is 50 m. Based on the indicators of water trophic conditions, it can be concluded that the lake belongs to the mesotrophic type.

Gruža reservoir was constructed in 1983 by building a dam 26 m high in the middle part of the Gruza river drainage basin. Its basic purpose is to supply drinking water for Kragujevac, Kraljevo and surrounding places. The reservoir is located at an altitude of 238-269 m. Its total volume in the period of investigation was 64,6 x 10° m? and the surface area was 934 ha. Gruza reservoir has a drainage basin of 318 km, and maximum depth of 31 m. Based on the level of primary organic production and analysis of plancton species as indicators of trophic conditions, it can be concluded that the lake belongs to the eutrophic type (Martinovié-Vitanovié & Kalafatic, 1990).

RESULTS AND DISCUSSION

Qualitative and quantitative composition of the fungal community

Having analized the fungal community density in the studied reservoirs during the first season, the following conclusions were reached (Tab. 1). Average number of spores in the water of different reservoirs varied significantly. Results of the statistical analysis show that the greatest average number of spores (4990 in one liter of water) was found in the eutrophic Gruza reservoir at the location (L3), and the lowest one (2000 in one liter of water) was found in the oligo-mesotrophic Celije reservoir at the location (L2). The greatest quantity of spores was found in the coastal areas rich with macrophytes (L3). Number of spores in all reservoirs is higher in the lower water layers (near the bottom — L1) than in the middle water layers in the central parts of the lakes (L2). Increase of the spore number at the lower water layers of the reservoirs (L1) is the result of flushing the sediments from the bottom. Very high number of spores was observed at the lower water layers of Gruza reservoir (L1), probably as a result of the fact that at the bottom of this reservoir there is a high quantity of silt rich with organic compounds, suitable for growth of some fungi.

By monitoring the seasonal dynamics of the number of spores, it can be observed that it is the highest in the water samples taken in March and October. This can lead to the assumption that the increased number of fungi in this period is related to atrophy of macrophytic vegetation as well as with inflow of soil fungi into the lakes in the period of stream torrents. Besides, in the fall and winter periods, due to greater and more frequent movements of water flows, higher number of fungi from the silty bottom of lakes can enter the free water flows. The highest number of spores was observed in March on all locations of the studied reservoirs (Tab. 2). The maximum average number of spores was found on the location (L3) of Gruža reservoir (8320 spores/l of water). The minimum

Source : MNHN, Paris

B. RANKOVIC

RESERVOIR | AVERAGE NUMBER OF SPORES/LITER OF WATER L1 12 L3 Сеше 2700 2000 2400 Groënica 3300 2250 4050 Gruza 4100 3700 4990

RESERVOIR

4 CELIJE

Table 1. Number of fungal spores in the water of reservoirs in Serbia

Sampling

location

Average number of spores/one liter of water

AUGUST

L3 3724

318

2840

2718

Y GROSNICA

L4 6245

714

3166

3075

Table 2. Seasonal dynamics of the number of spores in the water of reservoirs in Serbia

Source : MNHN, Paris

FUNGAL SPECIES

CELNE